今天我们一起参照ChP2020版《0931溶出度与释放度测定法》和USP <1092>溶出方法的开发与验证的内容一起来学习一下溶出方法开发过程中所需要掌握的核心要点。

在进行溶出分析方法开发过程中，我们一般认为一个好的溶出测试方法应能提供三个关键方面的信息。

其一，溶出方法和检测方法协同作用下能够准确的反应出固体制剂药物释放速率或浓度的变化，通过对这些信息的准确监控能够有效地建立起Batch TO Batch质量一致性的控制手段；

其二，开发成型的溶出方法和检测方法能够准确区分CMC过程中不同处方和工艺制备的产品，也就是说溶出分析方法具备处方成分及工艺的敏感性；

其三，溶出曲线能够在适当体内-体外模型条件下准确反应释放-吸收形态学特征。

相信从上文介绍中小伙伴们也都观察到了，溶出分析方法开发过程中会被“割裂”成相互关联但有具备一定独立性的两个部分，即溶出实验部分和检测实验部分。

1、溶出介质及其体积

在进行溶出方法开发时，首要考察的就是溶出介质，在进行溶出介质选择过程中需要根据原料药、辅料等理化性质进行合理筛选，当需要确定溶出度实验过程中溶出介质的成分组成时，还需要对缓冲液、溶液pH、表面活性剂（阳离子、阴离子、两性等）影响进行充分评估。

一般而言，在进行固体制剂溶出介质的考察时，我们以各国药典作为主要参考依据，同时根据实际生产工艺进行综合研判，选择出具有强区分力的介质，且通过摇瓶法来测定API在不同介质状况下的饱和浓度，从而更好的佐证和评估药品的溶解特性。

溶出实验中常见的溶出介质一般包括：稀盐酸、磷酸/醋酸缓冲溶液（pH值范围为1.2-7.5）、人工胃液/肠液（可含活性酶）等。在溶解介质的选择过程中还需要充分考量表面活性剂的助溶、增溶和潜溶作用，对于部分药物在不相溶的特定缓冲溶液中可能需要添加部分表活成分或者改变酸碱的浓度，进而充分达到溶出的目的。

有时候水溶性介质中(酸性水溶液或缓冲溶液)可能添加一定比例的表面活性剂(如十二烷基硫酸钠(SDS)，聚山梨醇酯，或十二烷基二甲基氧化胺)以提高药物的溶解度。在进行表面活性剂的添加考察过程中要充分注意表活的生理毒性（阳离子>阴离子>非离子）和溶血作用（聚乙烯烷基醚>聚氧乙烯芳基醚>聚氧乙烯脂肪酸酯>吐温类,吐温20>吐温60>吐温40>吐温80）。并且在确定表面活性剂后还应充分考察表面活性剂浓度变化的影响，从而掌握最低添加量。下表1中对表面活性剂的临界胶束浓度(CMC)进行简单列举，通常在进行溶出介质考察过程中表面活性剂的添加浓度近似与其CMC值。

▲表1-常规表面活性剂CMC浓度举例

此外还应该注意，不同级别（纯度）的表面活性剂的使用会对药物的溶解度造成影响。

因此要控制表面活性剂的级别和纯度。例如，SDS只有在工业级和高纯度级才可以使用。在使用HPLC方法进行分析时，不同来源的聚山梨酯(吐温)80会对方法的适用性产生不可预估的影响。

通常在溶出方法验证过程中不推荐直接使用纯化水作为溶出介质，而一般采用缓冲盐溶液，因为纯化水的质量和pH条件并不能稳定重现，其受到实验室洁净环境、温度、制水仪器等多方条件的影响，无法像缓冲盐溶液一样便于程序化控制。但在某些特殊情况下（如：pH不敏感制剂等）也可以采用纯化水作为溶出介质，从而降低实验强度。

当前溶出方法开发验证过程中也见识到部分兄弟单位的小伙伴会选用生物相关介质进行溶出实验，个人在这里持有中立的态度，如果生物介质并没有临床数据相关性作为支撑的话，这套溶出方法的不可预测性就会大大增加！！！并且生物相关介质其成本和风险控制需求将会几何倍数的提高，往往还会陡增溶出开发的难度。因此个人认为在进行溶出方法开发过程中最优选择依旧是简单的缓冲盐体系，匹配目标化合物自身特性所建立的方法可能具备强可预测性。

溶出实验的结果对于处方工艺精进具有重要的作用，通常溶出相关介质用于模拟复杂的人体胃肠道溶液，从而更好掌握某一化合物在体内的溶解性和稳定性，同时也用于处方筛选。

日常进行溶出方法开发过程中溶出介质的体积会控制在500-1000mL，温度保持在37±0.5℃，测试装置(如篮或桨)固定到轴上后，调节至规定的转速。按照药典要求将装置固定到轴上的相对位置上。在溶出过程中，应盖住溶出杯防止溶出介质的蒸发（需要注意的是溶出介质种类和体积需要满足漏槽条件，即介质体积至少是能形成其饱和溶液体积的3~7倍，是做溶出的最佳条件）。倘若在制剂的溶出曲线测定过程中溶剂的体积超过此漏槽条件，可视样品在溶剂中的溶出过程不受溶剂体积的影响。

一个药品的所有规格最好使用同一种方法和相同的介质体积，这样可以对各个规格的溶出曲线进行评估，也能对相同或相似处方进行溶出评价。这种方法可以揭示高规格和低规格是否在体外溶出相似。此外，不同规格使用相同的溶出方法，可以在特定情况下为只研究高规格和低规格提供便利。

2、溶出方法及其转速

中国药典中常用测定方法包括第一法（篮法）、第二法（浆法）、第三法（小杯法）。其中小杯法的适用范围小。

篮法——75rpm/100rpm，以100rpm为主。适用范围有胶囊剂、丸剂、片剂、或是一些漂浮的制剂。

桨法——50rpm/75rpm，以50rpm为主。适用范围有片剂、胶囊剂和丸剂。（经验认为桨法50rpm相当于转篮法100rpm）

只有当指导原则推荐的转速参数不适用的情况下，才可考虑使用其它转速，使用其它转速应有充分证据。选择一个不同的介质（例如，对这个化合物具有较高溶解度的）来加快溶出比增加转速更好。

当使用篮法装置时，应将样品放在干燥的篮里，篮固定在连接的圆盘上，然后降低至规定的位置，立即开始转动。当使用桨法时，样品应在溶出杯的底部，立即按规定转速开启桨。如果要求使用沉降装置，样品应放在沉降装置中，使其沉于溶出杯底部。在合适的时间点取样，用合适的方法滤过，滤液作为样品溶液。分析样品溶液中的药物，以相对标示量的百分含量表示规定时间的溶出量。

在使用沉降篮对易于漂浮的剂型进行溶出测定时，应充分评估不同类型沉降篮对溶出结果所产生的影响，沉降溶出曲线会造成显著的影响！当转移这个方法时，原则上应使用相同的沉降篮，如果无法获得相同沉降篮必须使用不同设计的沉降篮时，则应当证明两种不同的沉降篮产生的结果相同。

在溶出方法开发中一个好的诊断工具是在溶出试验结束后增加“无限转速”（即无穷大点），以使颗粒被强制分散同时使未溶解的API溶解。例如，可在最后一次正常取样点后，将转速增加至150~250rpm维持15~30min，再进行取样。这种做法可以快速检查制剂的含量，并确保溶出不是受到溶解度的限制或者低的溶出量不是由含量低引起的。虽然在溶出曲线中不要求100%的溶出，但是无限点可以比较药物的均一性并可以提供有用的信息，用于评估初始开发过程中的制剂特性或方法偏差。然而对于批放行检验，转速的增加值是受到限制的。

3、取样时间点、过滤及终点确定

在速释制剂溶出方法开发时，取样时间点一般从5min到60min以上。5min点可用于混悬剂或其它快速溶出剂型，此时变异不高。典型的取样时间为 15、30、45、60min。然而，取样时间点取决于产品特性和方法追踪处方核心属性的能力。如果希望更好地研究或追踪崩解效应，5min或10min时间点都是需要的。对于快速溶出产品，光纤溶出系统可以通过更多的取样时间点得到更好的溶出曲线。如果在溶出液稳定性方面有显著的风险，那么应在60min后增加一个取样时间点以保证至少获得85%的平均溶出量（Ps.实际取样时间与规定时间的差异不得过±2%，自取样至滤过应在30秒内完成。）。

一般来讲，15min点是很有用的，特别是化合物在这段时间内已经溶出至少85%。如果是在0.1M HCl中满足这种情况，FDA通常判定这个制剂的行为与溶液一样，无任何生物利用度方面的问题。15min这个时间点也是BCS3类药物能否获取BE豁免的一个重要时间结点。另外，经验而言，对于在15min内溶出≥85%的溶出曲线，其相似性评价时可以不采用f2因子法。

如果使用f2因子法，则需要进行多个时间点溶出度测定，至少两个取样时间点平均溶出值低于85%(一般是n=12)并且两组产品的溶出度值只有一个时间点大于85%。因此，在早期增加时间点检查是有必要的。

对于缓释剂型溶出试验，至少选择三个时间点确定体外释放曲线，确保药物释放完全(>80%)；对于含有多个活性成分的产品，需要确定每种活性成分的药物释放。

为获得准确试验结果，过滤是样品制备的一个关键步骤。过滤可除去会干扰分析测定的不溶性辅料。如果不把未溶解的药物和辅料从样品溶液中除去，那么未溶解的药物颗粒将会继续溶解使试验结果出现偏差，因此，如果取样管中没有过滤器，应立即对溶出度样品进行过滤。

选择适当的过滤材料是非常重要，应该在早期溶出方法开发的过程中通过实验确定和完成。在选择滤膜时有必要重点考虑滤膜的材料、型号和孔径大小。通常根据对早期阶段溶出方法开发过程的评价选择过滤器，但在后期试验中如果制剂成分改变或组成成分质量变化可能需要重新考虑过滤器(例如:微晶纤维素粒径的改变)。

用于溶出试验的过滤器有管路过滤器、过滤盘或玻璃过滤器、滤头或针头式过滤器，过滤材料在选用的过程中必须确认其与介质和药物相适合。对溶出样品进行过滤不但可以减少取样后API颗粒的溶出，还可以降低辅料颗粒堵塞分析设备的风险。典型的滤膜孔径是0.20~70µm。如果原料药的粒度很小(例如，微分化颗粒或纳米颗粒)，分析者应尽可能使用最小孔径的滤膜，就目前的过滤技术而言对这类微小颗粒的过滤至今仍具有一定的挑战。

药物的剂型、含量及其UV吸收等对溶出分析方法起到决定性的作用，HPLC/UPLC是一种典型的分析方法，在LC分析中，对低规格药物通常建议采用增加进样体积的手段来增加检测灵敏度，而非增加浓度的方法（即减少溶出介质）。

4、色谱条件的确认

在方法最初开发阶段，溶出方法的定性评估可以节约大量的时间，某一测试的要求没有满足，可以不进行样品分析。通过观察制剂的溶出现象，可以在不进行样品分析时就能很快的发现处方或溶出方法的问题。

溶出度的检测方法，首选以含量测定方法为原点进行优化。若含量测定方法合适，则可与其方法一致，省去一部分开发内容。但也存在含量测定方法监测时间过长的情况！倘若采集时间较长（一般认为液相方法采集时间＞20min，就算偏长了，具体情况自行评估喔~），建议对流动相梯度进行针对性优化，尽可能的缩短采集时间，否则就后续溶出曲线的测定将会是一件漫长的事情……时间一长就难保不会出现其他意外（稳定性？溶出控制？溶出节点把控等等……）

对含量测定的方法挪作“他”用，用于测定溶出度时，由于其溶出介质和含测过程中的溶剂会具有一定的差异性，分析目标物的浓度也不具备稳定性（不断溶出不断升高），因此在分析过程中色谱柱载量需要重点关注，目标物的峰形和柱效也有变化的可能~因此需要着重考察系统适应性相关参数。

综合上述的介绍可以看出，要想做好一个完善的溶出方法学，不仅离不开对液相方法开发，还要增加大量的溶出内容的开发，就其难度系数而言算是所有方法学开发验证过程中较为复杂的一类。