1. 概述

蛋白浓度测定常使用BCA法，这是一种比色法测定，此外，我们也可以直接通过紫外吸收法来测定蛋白含量。

后者操作更简单，不需要显色，整个测定时间非常短。适合用于对蛋白含量和纯度进行粗略判断的场景，例如SDS-PAGE电泳前大概估算一下蛋白浓度，或者是判断溶液中是否含有杂质污染。

紫外吸收法通过测量蛋白质中的芳香族氨基酸，如色氨酸、酪氨酸，在280nm处的吸光度来定量。此法的优点在于简便快速，尤其是样品测定后还能回收继续用，不会被检测过程消耗掉。

此外，紫外吸收法不受低浓度的盐干扰，如生化制备中常用来盐析的硫酸铵及大多数缓冲液，因此格外适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为只需要知道蛋白质浓度的相对变化水平，而不需要绝对定量。

2. 实验原理

●最常见的方法是直接测280nm处的吸光度，这是由于酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，在此处有一个吸收峰，且在各种蛋白质中的含量相差不很大。

●此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。肽键相关的吸收峰较多，214nm处也可作为参考。

●核酸在260nm处有一个最强的吸收峰，可用于校正。

3. 三种紫外吸收法

1. 280nm的光吸收法

此法只测定280nm一处的吸光度，思路是将待测样本配制为溶液在紫外分光光度计上直接读取280nm处的吸光度A280，蛋白质浓度需控制在0.1~1.0mg/mL内。将读数与文献数据对比，计算蛋白质浓度。

如果待测蛋白较为冷门，查不到已知数据，可选用一种酪氨酸和色氨酸含量与待测蛋白质相近的蛋白质作为标准蛋白，测定其标准曲线，用以后续参考计算。

以下以BSA为例展示一组测定标准曲线的配制。标准蛋白质溶液浓度应为1.0 mg/ml。

注意：做标准曲线需要设置空白对照组（下表编号1）；每一组应做三次技术重复以减弱误差；比色皿换样本时应用蒸馏水清洗2~3次以避免上一次检测的溶液残留导致误差。

此处虚拟一组吸光度数据，绘制出标准曲线：

假设我们的待测样本其吸光度A280做了三次技术重复后平均值为0.668，在标准曲线纵轴上找到0.668的位置，根据标准曲线，可知蛋白质浓度在0.334mg/mL附近。

2. 280nm和260nm的吸收差法

核酸的吸收高峰在260nm附近，在260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。此处提供一则广泛应用的经验公式：

纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 = 1.8

纯核酸的光吸收比值： A280/A260 = 0.5

含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，代入以下公式计算蛋白质浓度：

蛋白质浓度(mg/ml)=1.45×A280－0.74×A260

此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的。我们已将其纳入老司机开发的计算器：实验快算中，只需输入两个读数即可计算。

此处我们虚拟两个实验数据：

A280：0.511

A260：0.803

输入 蛋白浓度紫外吸收换算 计算器，获取结果：

3. 215nm与225nm的吸收差法

若蛋白质浓度低到不能使用280nm的光吸收检测，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。

与方法一类似，还是使用已知浓度的标准蛋白质，配制成20～100 mg/mL的一系列5.0 mL的蛋白质溶液，分别测定其215nm和225nm的吸光度值，并计算吸收差D：

吸收差D= A215 －A225

以吸收差D为纵座标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。将未知样品的吸收差代入曲线，即可查出未知样品的蛋白质浓度。

4. 注意事项

进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此需特别注意待测样本溶液的pH值应与测定标准曲线所处的pH值保持一致；

紫外吸收法毕竟是通过吸光度进行间接测量，准确率较差。如对精度有较高要求，还需结合或选择其它方法；

如果使用已知的标准曲线，若待测样本的酪氨酸与色氨酸含量与其所用标准蛋白的差异较大，会造成一定误差；

若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰，这一部分虽然可以通过方法2计算校正，但不能完全抹消误差。

5. 参考文献

[1] 张建社，褚武英，陈韬，2009，蛋白质分离与纯化技术，军事医学科学出版社