1、复苏后细胞漂浮

1、细胞本身贴壁能力较弱

具体分析：以细胞转染的明星细胞293T为例，它生长较快，但贴壁能力弱，容易出现明显的成片脱落现象。

解决办法：提前使用明胶包被板子，增强吸附性。另外，还建议使用TC处理（tissue culture treated）的培养瓶/皿促进细胞贴壁附着。

2、培养条件不适合

具体分析：以293T细胞培养举例，推荐使用的培养基为DMEM（高糖）+10%FBS，但是如果使用RPMI-1640+10%FBS做为培养基，培养液糖分不足，故不够支持细胞生长所需。虽然用错了培养基，但这不代表细胞一定不能生长。但如果培养细胞中长时间使用不正确的培养基，甚至缺少必要营养组分（例如优质的血清），那细胞真就容易漂了。

解决办法：参照细胞使用说明书或者实验室预实验结果，使用合适的培养体系。对于间充质干细胞这类“口味挑剔”的细胞，培养基和血清的质量要求会更高。

3、复苏过程中操作不当

具体分析：复苏过程水温太低，解冻时间不足，冰晶损伤了细胞；水温太高，烫伤了细胞。

解决办法：复苏细胞过程，一般是从液氮罐中取出冻存管，立即放入到37℃水槽中快速解冻，摇晃冻存管，确保在1分钟内完成解冻。

4、去除冻存液中残留的DMSO过程，离心对细胞造成损伤

具体分析：在细胞复苏过程中，解冻完毕之后，为了防止残留DMSO对细胞的毒性影响，很多小伙伴会将细胞悬液转入到15mL离心管内，离心去上清，再重悬细胞接种培养。但这种情况，会导致刚复苏还极为脆弱的细胞，因为离心机的离心力更为脆弱甚至破损死亡。

解决办法：其实除了少数对DMSO敏感的细胞之外（例如DMSO诱导HL-60分化成类中性粒细胞），绝大多数细胞应在解冻之后，直接接种在培养皿内，隔天再更换新鲜培养基去除DMSO。

2、传代后细胞漂浮较多

1、胰酶消化时间过长（主要针对贴壁细胞）

具体分析：不同贴壁细胞的黏附能力不同，因此胰酶消化时间需要考虑到细胞性质。例如贴壁能力弱的293T细胞，消化时间为2-3分钟（甚至可能更短），而A549细胞系的消化时间则是5-6分钟。同时，不同实验室条件也有差别，甚至不同品牌的胰酶消化能力也有差距，需要控制消化条件。

解决办法：消化过程中，缩短胰酶消化的时间，以显微镜下观察到细胞变圆作为终止消化的标准。

2、过度吹打细胞带来机械损伤

具体分析：吹打细胞的情况主要有两种，一是胰酶消化时间不足，为了收集更多的细胞，不少小伙伴会对剩余的贴壁细胞进行吹打。二是在接种细胞之前，去除上清液后加入新的培养基重悬细胞时候的吹打。这两种情况下，吹打细胞的过程太长或者用力过度，会带来细胞承受不了的剪切力和挤压力等机械应力。

解决办法：

胰酶使用前进行复温，胰酶消化时间不能太短，以显微镜下观察到细胞变圆作为终止消化的标准。

减少吹打细胞的次数和时间，吹打至肉眼无可见细胞团即可。

3、培养条件不适合

同上述PART 01 “细胞漂浮”问题解答。

4、细胞接种密度过高

具体分析：细胞多，平分到的培养基营养成分就显得“僧多粥少”。同一批次，不同培养皿内接种的细胞数量差异太大。或者一个培养皿内，细胞分布不均，存在某些区域细胞过多，而另外区域细胞数量极少甚至没有的情况。

解决办法：细胞重悬均匀，推荐1:3或者1:4的比例进行传代。小伙伴们也可以根据细胞量进行更改，进行1:2或者1:5传代。接种细胞之后，对培养皿进行水平均匀晃动，画数字“8”或者十字晃动，保证细胞在培养皿上均匀分布。

3、细胞生长太慢

1、细胞接种密度过低

具体分析：与细胞接种密度过高不同的是，接种的细胞数量少，细胞相对获得的营养成分极为充足并不能帮助细胞快快生长。

解决办法：根据细胞数量调整传代比例，适当增加接种细胞的初始浓度。

2、培养基配置/使用/保存不当

具体分析：培养基在室温放置时间过久，导致效能下降。也有可能是血清批次问题，血清效能的不稳定导致不同时间配置的培养基效能存在差异。

解决办法：完全培养基配置时注意各组分保存温度及性状是否正常，无异常再进行配置；另外，使用效能稳定的血清，以保证不同批次甚至不同类型细胞的稳定生长。