小鼠淋巴细胞是其免疫系统的关键组成部分，主要包括T细胞、B细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）。T细胞分为辅助性T细胞（CD4+）和细胞毒性T细胞（CD8+），分别在调节免疫反应和直接杀伤感染细胞中发挥作用。B细胞负责产生抗体和抗原呈递，而NK细胞则通过识别和消灭异常细胞快速响应感染和肿瘤。这些淋巴细胞广泛分布在小鼠的脾脏、淋巴结、胸腺和骨髓等组织中，是免疫学研究的主要模型，有助于理解人类的免疫机制。

脾脏作为重要的免疫器官之一，含有丰富的淋巴细胞，占全身淋巴组织的25%。由于小鼠的血液量较少，从外周血中难以分离出足够的淋巴细胞，因此通常需要从小鼠的脾脏中获取大量的淋巴细胞。

一、实验步骤

1、准备材料和试剂

选择成年小鼠，确保其具有正常的免疫功能。断颈处死小鼠，并将小鼠尸体浸泡在75%酒精中进行消毒处理。准备已消毒的眼科剪刀和镊子，无菌6cm培养皿、冰PBS。

2、处理小鼠脾脏

用剪刀和镊子取出小鼠的脾脏，置于含有冰冷PBS的培养皿中。将脾脏放在70微米细胞筛网上。使用5 ml注射器的活塞在筛网上轻轻研磨脾脏，逐步加少量冰PBS，直至脾脏完全被研磨成细胞悬液。将通过筛网的细胞悬液收集到15 ml离心管中。

3、离心

1）在一个15 mL的离心管中，首先加入5 mL的Ficoll分离液。然后将管子倾斜，轻轻地将含有淋巴细胞的PBS缓慢倒入Ficoll分离液中。此时，会观察到明显的液体分层现象。

2）接下来，以600 rpm的速度进行梯度离心25分钟，升速和降速均设置为2。离心结束后，液体将分成三层。随后，小心地吸取中间层的液体（其中含有淋巴细胞和少量红细胞），转移到一个新的15 mL离心管中，并补充PBS，再次以600 rpm离心5分钟。

3）离心后，弃上清，加入1~2 mL的红细胞裂解液，在冰上处理5分钟。最后，再补充PBS，以600 rpm离心5分钟。

4）弃上清, 可见白色沉淀，此时沉淀为总淋巴细胞。

二、注意事项

1) 使用Ficoll溶液进行离心分层后，血液成分会按密度梯度重新排列。血浆和血小板由于密度较低，会浮在分层液的上部；PBMC（外周血单个核细胞）的密度稍低于Ficoll溶液，因此在界面处形成一层白膜；而红细胞和粒细胞因密度较高，会沉积在分层液的底部。

离心结束后，从管底往上依次是红细胞、粒细胞、Ficoll细胞分离液、淋巴细胞、血小板和血浆。在提取淋巴细胞时，需要小心地移除上层的血浆和血小板，然后再吸取位于界面处的淋巴细胞层。

2) 梯度离心时要小心吸取中间层的细胞悬液，尽量避免吸入上层和下层的液体。

3）加入红细胞裂解液后，应在冰上处理5分钟，以提高裂解效果并保持细胞活性。处理结束后立即补充PBS并进行离心，以去除裂解后的红细胞残渣。

4) 上述所有步骤都必须在无菌环境中进行，使用无菌试剂和耗材。