外泌体RNA的提取与普通细胞RNA提取的差别之处在于我们得把外泌体分离出来然后裂解外泌体才能获取RNA。外泌体可以由体内绝大多数活细胞产生，常见的外泌体RNA主要有细胞外泌体RNA、血清外泌体RNA等，这里我们以细胞外泌体为例，介绍外泌体RNA提取的实验步骤和注意事项：

一、实验步骤

1、外泌体的分离

（1）细胞培养上清的收集与预处理

细胞培养上清收集：如果是从细胞培养上清中获取外泌体，先培养细胞至合适的密度。

对于贴壁细胞，用PBS轻轻洗涤细胞2~3次，去除残留的完全培养基（RPMI1640+FBS+PS）,更换为无外泌体血清的培养基继续培养24~48h。之后，收集细胞培养上清，转移至离心管中。

对于悬浮细胞，离心收集细胞，用PBS重悬后，转移至无外泌体血清的培养基中培养适当时间后收集上清。

（2）外泌体分离

目前分离外泌体常用的方法主要是超速离心法或者直接购买试剂盒提取的方法。而试剂盒提取的原理主要也是参考试剂与外泌体结合、试剂沉淀外泌体等方法。下面主要介绍三种外泌体提取方法：

1）超速离心法是一种经典的外泌体分离方法。将收集的细胞培养上清转移至超速离心管中，绝对配平。首先，以300×g离心10min，去除细胞和大的细胞碎片；然后，将上清转移至新的离心管，以 2000×g 离心10min，进一步去除细胞碎片和微囊泡；接着，将上清再转移至超速离心管，以100000 - 120000×g离心60~90min，使外泌体沉淀在管底。小心弃去上清，用适量的PBS重悬外泌体沉淀。

2）沉淀法：即直接购买试剂盒，利用一些沉淀试剂（ExoQuick等）来沉淀外泌体。按照试剂说明书，将适量的沉淀试剂加入样本中，混合均匀后，在4℃下静置过夜。然后，离心（如1500×g,30min）收集沉淀，用PBS重悬。

3）免疫磁珠分离法：如果有外泌体特异性的抗体标记的磁珠，将样本与磁珠混合，使外泌体与磁珠结合。将离心管置于磁力架上，使磁珠（结合外泌体）吸附在管壁一侧，弃去上清。用 PBS 洗涤磁珠-外泌体复合物几次，然后通过一些方法（如加入洗脱缓冲液）将外泌体从磁珠上洗脱下来。

2、裂解外泌体分离RNA

通常购买外泌体RNA提取试剂盒会存在外泌体结合柱和RNA吸附柱可以直接方便获取外泌体RNA，然而普通的RNA提取方法也同样适用于外泌体RNA的提取，例如TRIZOL法。

（1）柱式提取法：购买专门用于RNA提取的柱式试剂盒。按照试剂盒的说明书操作，一般先将裂解后的外泌体样本加入到结合柱中，通过离心使 RNA 结合在柱上。然后，用洗涤缓冲液洗涤柱子，去除杂质。最后，用洗脱缓冲液将 RNA 从柱上洗脱下来，收集洗脱液，即为提取的外泌体 RNA。

（2）TRIZOL法：该方法主要利用相分离的原理,向裂解后的外泌体样本中加入等体积的Trizol试剂，充分混匀。室温静置5min，使核酸蛋白复合物充分裂解。然后，加入氯仿（Trizol体积的 1/5），剧烈振荡15~30s，室温静置10min。之后，4℃，12000×g ，离心15min，溶液分为三层，RNA 在上层水相中。将上层水相转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，冰上沉淀10min。最后，4℃，12000×g离心10min收集 RNA 沉淀。配置75%浓度的乙醇洗涤RNA 沉淀2次，4℃,7500×g离心5min，小心弃去乙醇，在超净工作台中干燥RNA沉淀。最后，用适量的RNase-free水或DEPC水溶解RNA。

3、RNA 质量检测

通常我们使用分光光度计（如 Nanodrop）检测 RNA 的浓度和纯度，观察 A260/A280 和 A260/A230 比值。A260/A280 比值在 1.8 ~2.0 之间表示 RNA 纯度较好，A260/A230 比值一般应大于 1.5。另外，我们还可以通过琼脂糖凝胶电泳（如用 1% ~ 1.5%琼脂糖凝胶）观察 RNA 的完整性，值得注意的是，真核生物外泌体RNA主要为小RNA，如 miRNA 等，会出现较模糊的条带分布在小于200bp的区域。

二、注意事项

（1）首先分离外泌体我们需要保证获取的外泌体量足够多，因此细胞密度一定要足够，例如选择使用大的培养皿（10cm）或者T75瓶培养细胞。加入适量的去外泌体血清完全培养基培养24~48h之后收集细胞上清。

（2）利用超速离心法收集外泌体，我们要保证离心管绝对配平 ，必要时需要给 离心管进行称重。

（2）外泌体RNA提取过程中，我们要防止 RNA 降解。因此，整个实验过程要严格遵守无 RNase的规范操作。使用的耗材（如离心管、枪头）应为无 RNase 的产品，应戴手套、口罩等，避免RNase污染。另外，提取过程尽量在冰上下进行，如裂解和沉淀步骤可在冰上操作。

（3）外泌体RNA利用异丙醇沉淀或者用75%的乙醇清洗时，需要有技巧的摆放离心管的位置，防止沉淀不明显吸取上清过程中丢弃RNA沉淀。