维生素A（Vit A）是最早被认识并应用于临床的维生素，属脂溶性维生素，为全反式视黄醇的一组有活性的β2紫香酮的衍生物，包括视黄醇、视黄醛、视黄酸（RA）及其酯类[1]。Vit A对机体的生长发育、组织细胞增殖与分化均具有广泛的调控作用[2]。鱼肝油收载于《中国药典》2005年版，是维生素类非处方药，其中含有维生素A和D是人体生长发育的必需物质，尤其是对胎儿、婴幼儿的发育，上皮组织的完整性，视力，血钙和磷的恒定，骨骼、牙的发育等有重要作用。复合鱼肝油制剂是由鱼肝油及多种维生素和辅料加工制成的溶液剂，临床用于预防和治疗因维生素A和D以及B族维生素缺乏所致的各种疾病。为了解本品质量，保证临床疗效，我科采用高效液相色谱法测定复合鱼肝油制剂中维生素A的含量，现报道如下： 
　　 
　　1 仪器与试药 
　　岛津LC-10ATVP高效液相色谱仪，大连中北色谱工作站；AT-201电子分析天平（分辨率d=0.01 mg，瑞士梅特勒)，岛津UV-2550紫外-可见分光光度计。维生素A醋酸酯对照品（规格：20 mg，含量为100%，广州珠江制药厂提供）；复合鱼肝油制剂（鱼肝油乳剂，规格：500 ml/瓶，国药准字H44024528，广州珠江制药厂生产，批号：081105；081102；080202）。甲醇为色谱纯，水为双蒸纯化水，其他试剂为分析纯。 　　 
　　2 方法与结果 
　　2.1 色谱条件 
　　选择迪马（Diamonsil） C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，流动相为甲醇-水（95∶5），检测波长为326 nm，流速为1.0 ml/min，进样量为20 μl，柱温为35℃。 
　　2.2 溶液的制备 
　　2.2.1 对照品溶液制备 
　　取维生素A醋酸酯对照品约100 mg，精密称定，置100 ml容量瓶中，加环己烷至刻度制成每1 ml含1 mg维生素A醋酸酯的对照品贮备液。精密吸取10 ml贮备液，置100 ml容量瓶中，用甲醇稀释成每1 ml含0.1 mg维生素A醋酸酯的对照品溶液。 
　　2.2.2 供试品溶液制备 
　　精密量取复合鱼肝油制剂5 ml置分液漏斗中，加入无水乙醇20 ml，振摇5 min，精密加入环己烷25 ml，强力振摇15 min，静置使其分层；将无水硫酸钠铺至滤器，弃去水层，将环己烷层液体倒入滤器过滤，精密量取滤过液5 ml，置25 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。 
　　2.2.3 阴性样品溶液制备 
　　按处方组分比例制备成缺维生素A的阴性样品，按照供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。 
　　2.3 线性关系考察 
　　精密吸取浓度为0.1 mg/ml的维生素A醋酸酯对照品贮备液1.0、2.0、4.0、6.0、12.0 ml，置100 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度。摇匀后分别精密量取20 μl进样，按“2.1”项下的色谱条件测定。按照维生素A 1 IU =0.344 μg 维生素A 醋酸酯换算。记录色谱峰面积，绘制标准曲线，以对照品进样量（IU/ml）为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程Y=6.137 8X-0.615 3，r=0.999 6。结果表明：维生素A进样量在2.907 0~34.883 7 IU/ml（1~12 μg/ml）范围内与峰面积呈良好线性关系。 
　　2.4 阴性对照试验 
　　取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液，分别进样20 μl，结果在维生素A色谱峰相应保留时间为6.8~10.0 min，阴性样品溶液无干扰峰出现。维生素A 的保留时间为8.85 min。 
　　2.5 精密度试验 
　　精密吸取供试品溶液，进样20 μl，重复进样6次，测定维生素A峰面积，结果RSD为0.48%，表明本法精密度良好。 

　　2.6 稳定性试验 

　　取同一供试品溶液，室温放置，分别于0、0.5、1、2、4、8 h进样20 μl，测定维生素A峰面积。结果RSD为0.75%，表明样品溶液在8 h内稳定。 
　　2.7 重现性试验 
　　取供试品样品（批号分别为081105；081102；080202），每批3份，共9份，依“2.2.2供试品溶液”项下方法制备供试品溶液，分别进样20 μl测定，RSD为0.58%，表明本法重现性良好。 
　　2.8 回收率试验 
　　取已知含量的复方鱼肝油制剂样品（081105）6份各4 ml，分别加入精密吸取浓度为0.1 mg/ml的维生素A醋酸酯对照品贮备液1.0 ml，按供试品溶液制备方法加入无水乙醇20 ml，振摇5 min后，精密加入环己烷25 ml，强力振摇15 min，静置使其分层；将无水硫酸钠铺至滤器，弃去水层，将环己烷层液体倒入滤器过滤，精密量取续滤液5 ml，置50 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，充分摇匀，分别进样20 μl测定，计算回收率，结果显示其平均回收率为98.84%，RSD为0.75%。　　 
　　2.9 样品含量测定 
　　分别取“2.7”中所述三批次复方鱼肝油制剂样品各3份，共9份，依法制备供试品溶液，分别进样20 μl测定含量，按外标法计算含量，详细结果见表2。 
　　3 讨论 
　　维生素A是第一个被发现，也是一种极其重要、极易缺乏的，为人体维持正常代谢和机能所必需的脂溶性维生素[4]。常见的检测维生素A的方法主要有比色法、紫外分光光度法、近红外光谱法和高效液相色谱法[5]。《中国药典》中对鱼肝油乳剂中维生素A的测定采用计算分光光度法[6]，测定前需将鱼肝油制剂进行皂化处理，而皂化的处理过程容易导致维生素A降解，且测定步骤繁琐，计算复杂。测量时，容易出现测量值，校正值的差与测量值的比值超过-15~3的范围，导致含量无法计算，且不同仪器间误差较大[5]。高效液相色谱的基本原理是将微量经过提纯的试样注入加样系统，在高压条件下，试样被流动相带入色谱柱内，按照样品所含物质在固定相与流动相之间的分配系数、分子极性的大小以及所带的电荷数的多少，经过固定相与流动相之间多次交换进行分离，通过检测器检测，根椐检测获得的色谱结果峰高或峰面积可以精确地计算出所测物质的含量，方法简便，准确。 
　　本品为复合鱼肝油制剂，成分复杂，干扰成分较多，因此，在测定含量时我们对维生素A采用无水乙醇和环己烷提取，以甲醇-水（95∶5）为流动相，用流动相稀释维生素A对照品纯品，置紫外分光光度计下扫描，测得维生素A最大吸收波长为325~328 nm，故本实验采用326 nm作为检测波长。采用HPLC法测定复合鱼肝油制剂中维生素A的含量，可有效排除干扰，结果准确，重现性好，精密度高，可用于控制本品的质量。