作者：郭涤亮，药审中心
强制降解试验属于药物稳定性研究内容之一，也是药物开发研究的一部分，有助于揭示药物的稳定特性和可能降解途径，对于分析方法的开发和验证也具有重要意义。
稳定性研究通过设计一系列的试验来揭示原料药和制剂的稳定性特征，是原料药或制剂质量控制研究的重要组成部分，始于药品研发的初期，并贯穿于药品研发的整个过程。强制降解试验（stresstesting）属于稳定性研究内容之一，ICH Q1A指导原则对其定义分为原料药和制剂2个部分:强制降解试验（原料药）即是为了揭示原料药内在稳定性而进行的研究，它是开发研究的一部分，这些试验通常是在比加速试验更剧烈的条件下进行;强制降解试验（制剂）即是为了评估剧烈条件对制剂的影响而进行的研究，包括光稳定性研究（见ICHQ1B）和对特定制剂（如定量吸入剂、乳膏、乳剂和需冷藏的水性液体制剂）的特殊试验。综合以上定义，强制降解试验是指将原料药或制剂置于比较剧烈的试验条件下，考察其稳定性的一系列试验。查阅国内外相关的指导原则，除光降解试验的条件设置在ICH Q1B 中有较明确规定外，其他高温、高湿、酸/碱水解及氧化破坏的具体试验条件并未有明确规定。在技术审评中发现强制降解试验的开展常存在试验目的不明确、试验条件设计不合理、试验结果评价分析不充分等问题。本文在参考相关文献资料的基础上，结合审评和研发工作中的理解和认识，对合理设计和开展强制降解试验研究进行探讨。
开展强制降解试验是获得药物可能的降解途径和降解产物信息的重要途径，有助于更全面了解产品的杂质谱。对于分析方法的开发和质量标准的建立具有重要意义，是杂质检测方法建立、优化和验证的重要研究手段。可为药品的处方、工艺、包装、贮藏条件的确定提供有益支持。然而，由于药品的结构特性、剂型、工艺条件等各不相同，强制降解产生的杂质难于预测，对分析检测技术要求高，常给试验的设计和开展带来挑战。常见问题主要表现在未结合药物结构和制剂特点等进行合理设计，仅套用固定经验模式设置条件，达不到预期考察目的。如未针对药品特点进行分析和预试验，采用过于剧烈的破坏条件得到降解产物甚至次级降解产物，而这些降解产物存在于加速和长期试验样品中的可能性很小，这对于了解药物实际稳定特性以及验证分析方法的检出能力的意义不大。检测方法不适用也是常见问题，表现有未能建立合适的检测方法检出所有的降解产物，使主成分降解后测定的回收量偏低（质量不平衡），如降解为小分子物质（如无紫外吸收的降解产物）或形成聚合物，现有检测方法可能无法检出，或无法判断色谱主峰中是否包含降解产物峰，或存在溶剂峰、辅料降解等因素造成的干扰。另外，在完成强制降解试验后，对试验结果评价分析不全面，未能充分理解试验结果对分析方法优化、处方工艺改进、包材选择等方面的指示作用，并且未能采取相应风险管理措施，也是常出现的问题。
综上所述，试验条件设置不合理、检测方法不适用以及对试验结果缺乏理解分析，都会造成强制降解试验流于形式，达不到应有的研究目的。因此，强制降解试验需要合理的设计和开展，并对试验结果进行充分分析和理解。
一般5%~20% 的降解较为合适，需避免二次降解。对于难以降解的、非常稳定的化合物，应提供合理解释和判断依据。《化学药物杂质研究技术指导原则》中也指出，破坏试验的程度暂无统一要求，一般以强力破坏后主成分的含量仍占绝大部分为宜。此时已产生了一定量的降解产物，与样品长期放置的降解情况相似，考察此情况下的分离度更具有实际意义。要达到这种破坏程度，需要在研究过程中进行摸索，先通过文献调研、理论分析或预试验了解样品对光、热、湿、酸、碱、氧化条件的基本稳定情况，然后优化确定破坏性试验条件（如光照强度、酸碱浓度、破坏的时间、温度等），以得到能充分反映降解产物与主成分分离的结果和图谱。
检测方法对降解产物的检出能力和测定结果的准确性，对于开展有意义的强制降解试验十分重要，不同的检测方法可能获得不同的检测结果。降解产物通常采用色谱法测定，但由于具体药物的特点各异，必要时可能需要结合药物和降解产物的理化性质选择不同的色谱方法（如HPLC，GC，TLC 等）或检测器（如二极管阵列检测器、质谱检测器等），有时可组合采用不同分离机制的色谱系统。而另一方面，强制降解试验对于检测方法的优化、建立和验证具有重要意义。在强制降解试验条件下产生的降解产物较药品货架期产生的降解产物复杂、未知杂质多，分离难度大，因此强制降解试验对于验证检测方法的专属性具有重要的提示作用。需注意对降解前后质量平衡情况的考察，比较破坏前后检出的杂质个数和含量，回收率偏低时考虑是否有降解产物未检出，可能要进一步进行色谱峰纯度考察。因此，开展有意义强制降解试验需要有指示性的检测方法，而具有指示性的检测方法的开发和建立又是基于良好设计、有意义的强制降解试验开展之上的。
对于创新药，由于对其各方面的性质的了解是随研发进展不断深入的。因此，通过设计比较完整的强制降解试验，有利于比较全面地了解其稳定特性，从而为制剂处方、工艺的设计，以及产品储存条件的确定等提供有益的参考。对于这类药品，强制降解试验开展得越早越好，如在产品开发、分析方法建立阶段就可以同步进行，不要等到在长期稳定性放样，甚至临床使用中才暴露出问题。考察条件的设置也应尽可能全面，如尽量涵盖光照、高温、酸/碱水解及氧化等各种降解类型，各种降解类型考察中也可设置多种破坏强度，受试样品可分别在固体和溶液状态下进行考察。对于仿制药，一般可通过文献调研了解参比制剂或同类药品的稳定特性及其降解途径，并结合药物结构和剂型特点等先验知识，有侧重地考察已有较明确提示信息的特定降解类型，如多肽药物对光和热敏感，或药品结构中含有易水解基团。另外，当仿制药处方工艺或有关物质分析方法与参比差异较大时，特别是未对各有关物质进行全面定性研究或无相应杂质对照品对有关物质分析方法进行验证时，强制降解试验常作为验证检测方法专属性和灵敏度的重要手段。如可采用破坏性试验得到含有杂质或降解产物的试样，用建立有关物质分析方法与另一个经验证的，或药典方法进行含量测定，比较测定结果
稳定性研究应检验那些在贮藏期间易变化的、可能影响质量、安全性和/或有效性的项目; 检验应包括适当的物理、化学、生物、微生物学特性，以及稳定剂含量（如抗氧剂、抑菌剂）和功能性测试（如定量给药系统）。强制降解试验结束，应立即检查样品物理性质（如外观、溶液的澄清度或颜色）的所有变化，并进行含量和降解产物的测定。必要时还可根据品种的具体情况，针对可能影响药品安全性和/或有效性的相关质量属性设置考察项目。一般来说，强制降解试验只需选择一批样品进行，如果需进一步确认药品稳定特性，可增加样品批次进行考察。强制降解试验应根据特定药物的结构特点、理化特性、剂型、工艺、包装、储藏、临床使用情况等，有针对性地设置对产品开发、生产、使用、上市后变更等具有实际指示性的考察条件。而由于药品特点各异以及开展试验目的不同，很难明确普遍适用的考察条件，笔者在调研相关指导原则和文献［3，8－ 9］的基础上，对各降解类型试验条件设置的考虑进行介绍和探讨。
水解反应是物质与水发生的导致物质发生分解的反应，即物质与水中的氢离子或者氢氧根离子发生反应。大多数有机化合物的水解，仅用水是很难顺利进行的，一般需在碱性或酸性条件下进行，这是由于水解反应的发生需克服水解基团的水解活化能（activation energy，Ea），即需要考虑水解基团所处的电子和空间位阻效应。如药物分子中含有的羧酸酯、羧酸酰胺及磷酸酰胺等基团通常水解活化能较低（Ea 通常＜ 20 kcal·mol-1 ），是比较容易水解的位点; 如醚及磺酰胺基团，一般水解活化能较高（Ea 通常＞ 30 kcal·mol-1 ），通常不易发生水解。酸/碱水解考察条件的设置主要考虑因素包括:酸/碱溶液的浓度（或pH 值）、考察的温度与时间，具体考察条件需根据药品特点，特别是分析药物结构中含有的水解基团及其所处的电子和空间位阻环境。如对于含有羧酸酯的药物，其可能对碱水解十分敏感，就可使用较低浓度的氢氧化钠溶液，在室温条件下进行考察即可。而同样对于含有羧酸酯的药物，如果所处空间环境位阻较大，如叔丁基酯，可能水解条件需适当加强。另外，一些在水溶液中溶解度不好的亲脂性药物，需注意添加适当的有机溶剂进行增溶，不应一味地增大破坏强度，造成次级降解。常用水解考察条件包括: 0.1~1 mol·L-1 的盐酸或氢氧化钠溶液，在室温或加热条件下进行考察，如60 ℃ /2 d。
光照强制降解试验的条件设置在ICH Q1B［10］中有较明确规定，可分别在样品均质化或溶液状态下进行考察，一般要求总照度不低于1. 2 × 106 Lux·h（冷白光灯）或近紫外能量不低于200 w·h·m-2（紫外灯），如254 或365 nm 光源照射24 h。需注意将光照发热对受试样品的影响降到最低，还应考虑样品的物理性质，并应采取措施如冷藏和/或置密闭容器中，以确保物理状态变化（如升华、蒸发、熔化）所造成的影响最小。
对于热降解，一般遵循阿伦尼乌斯（Arrhenius）方程，即随温度升高降解速率加快。高温降解试验即运用这一原理，通过设置较高的考察温度在较短的时间内获得药品的降解信息。具体考察温度和时间需根据药品特点，在前期预试验的基础上灵活确定，常见如80 ℃ /10 d，130 ℃ /8 h。也常结合湿度进行设置，如对于原料药或固体制剂通常采用相对湿度75% 或更高（如80 ℃ /92． 5% RH等），而对于液体或半固体制剂可能需考虑采用干热条件（低湿度），如相对湿度25%或更低。受试样品可分别在固体和溶液状态下进行考察，需注意涵盖生产过程中最差条件的考察，如含主药的料液在喷雾干燥过程中温度升高，又如半固体制剂水相或油相溶解主药过程中可能需升高温度。对于破坏程度过高或过低的情况，可能还需进一步结合更接近于实际高温情况的影响因素试验（如60 ℃ /75%RH/1 个月）的考察结果，来综合判断是否药物本身对热特别稳定或特别敏感。
氧化是物质失去电子的过程，有机化学中常把脱氢称为氧化。氧化作为药物降解的常见形式，主要有亲核氧化和自由基介导的氧化2 种途径。亲核氧化主要采用双氧水来加速模拟亲核氧化反应的发生，通常形成环氧化物、氮氧化物、砜及亚砜等降解产物。自由基介导的氧化，机制为自由基的链式反应，前期链启动过程缓慢，特别是自发氧化，需要较长时间的介导过程; 而一旦链式反应启动后，降解速度会逐渐加快，因此一般不遵循Arrhenius方程，即与时间不呈线性关系，可能表现在稳定性试验后期无规律地出现降解产物。加速模拟自由基介导的氧化通常需要光、热、金属离子或引发剂［如偶氮二异丁腈（AIBN）、过氧化二苯甲酰（BPO）等］触发，常见的反应位点在共轭碳碳双键的α 位、苄基位、羰基α 位等。如生产管路的硅胶管成分复杂，含有的增塑剂（如BPO）可能作为引发剂触发自由基氧化反应。在自由基介导的氧化反应中，有一类被称为尤顿佛兰德（Udenfriend）反应，反应机制为:① 络合［金属络合剂如依地酸二钠（EDTA）、柠檬酸等］的还原性金属离子（如Fe2+，Cu1+等）介导氧气产生自由基。② 自由基形成后，通过夺取底物的电子进行传递，实现对底物的氧化。③ 抗氧剂（如抗坏血酸、苯酚类）或光照将被氧化的高价态金属离子（如Fe3+，Cu2+等）又还原为低价态，继续介导自由基的产生（见图1）。即还原性金属离子与金属络合剂络合后，在抗氧剂存在或光照条件下，反而会加速触发自由基的形成，导致氧化降解的发生。而针对这类氧化降解途径的考察，常常被忽视。如常作为注射剂中的稳定剂或缓冲剂的EDTA、枸橼酸等，可以与原辅料或生产容器管道中引入的金属离子（如Fe2+）络合，如果辅料或包材中含有抗氧剂（如酚类抗氧剂1010、抗氧剂1076 等），或PVC 输液管中含有的塑化剂MBHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚，具有还原性），都可能触发Udenfriend 反应，加速氧化降解。在氧化降解研究工作中，通常采用的试验条件为: 向受试样品加入20%~30% 的双氧水少量（如2mL），溶剂溶解样品至一定容量/室温/1~2 h。这样的试验条件一方面更多地体现了亲核氧化途径的降解情况，另一方面双氧水浓度过高容易产生人为降解杂质，可能与真实降解途径不符。以氟比洛芬为例（见图2），在氧化条件下容易生成EP 收载的杂质C，而如果氧化条件过于剧烈，会继续氧化成EP杂质D，甚至EP 杂质E，而在药品常规储藏条件下，杂质D 和E 由氧化途径产生的机会不大。因此，氧化降解试验需考虑试验条件的剧烈程度以及不同氧化机制的类型，采用适宜的氧化条件进行考察，如对于亲核氧化，采用0.1%~3% 的双氧水为氧化剂/中性溶液中/室温/7 d;对于自由基介导的氧化，采用偶氮类（如AIBN）或过氧化物（如BPO）引发/暴露于有氧环境/室温/7 d，或溶解于金属离子的盐溶液（如50 mmol·L-1 的硫酸亚铁溶液)中/暴露于有氧环境/室温/7 d。另外，直接将样品暴露在自然条件下（合适的光照与温度）模拟空气的自然氧化也有助于了解产品的实际氧化情况，但通常需设置足够长的考察时间。综上所述，对各降解类型的试验设计与开展进行了介绍，但强制降解试验不一定局限于单一降解类型的试验条件内，可以采取更灵活的方式来更好地预测产品可能的降解途径和降解产物。如对于原料药，可以考察溶液状态下产品在各破坏性条件下的变化。必要时还可以进行多种降解因素综合存在时的强制降解试验，如维生素K 的人工合成品甲萘氢醌二磷酸酯钠，在一定pH 值水解条件下，首先水解生成甲萘氢醌; 进而在氧化条件下，甲萘氢醌发生氧化反应，生成甲萘醌（见图3）。完成强制降解试验后，应根据试验目的与药品特点，对试验结果进行分析和评估，充分理解试验结果对药物稳定特性、处方工艺、杂质检测方法等方面的指示作用，并进行相应风险控制和改进优化。如光照降解试验显示受试样品降解趋势明显，且存在较严重的质量不平衡（如回收率低于95%），此时应根据考察结果分析评估试验的指示作用，可能还需要结合影响因素试验的降解程度和质量平衡情况，来判断光照试验条件的合理性以及有关物质检查方法的适用性。另外，试验结果显示受试样品对光照敏感，就应考虑对分析检测方法及操作、生产工艺、产品处理及存放等环节可能出现的风险进行分析和规避。
本文在参考相关文献资料的基础上，结合个人工作的理解和认识，对强制降解试验的合理设计和开展进行了初步的探讨，建议强制降解试验需根据试验目的，基于对各类型降解的先验知识，结合具体药物自身特点，合理设计和开展，并充分分析理解试验结果，从而更全面了解药物的稳定特性和降解途径，验证和优化有关物质检测方法，为药物开发、生产、包装、贮藏、使用等提供有益的参考。
