1 引言

生物活性分析（Bioassay）主要是指检测生物药物活性/效价（Potency）的方法，生物活性是生物药至关重要的CQA（critical quality attribute），是确保药物有效性的最重要指标。因为蛋白药物/抗体结构和活性的复杂性，生物活性分析一直是生物药行业质量分析中最具有挑战性的工作，如何持续地获得可靠和准确的结果是整个行业所需要突破和进化的。

2 生物活性分析开发的根据

稳定的活性分析结果需要受控的环境、经确认/校准的仪器、合格的试剂，经验丰富且理解细胞生物学、了解监管要求和最新技术趋势的分析人员，使用的分析方法需要经过完整的开发、表征和详细的方法学验证（可参见GMP 6大原则，参考文献1）。统计学分析（statistics）和风险管理RM（risk management）作为制药行业质量管理中广泛使用的工具，在生物活性分析的开发、验证和全生命周期（life-cycle）也能有效减少我们的工作量，提高数据的可靠性。

在生物活性分析的新方法开发中，面对新的活性药物成分（API）或生物类似药（biosimilarity）的复杂性质和/或严苛的相似性指标考虑，更多地需要引入统计学方法来为流程化方法开发和申报资料提供可靠的数据区间和新的解决思路。一般来说，耐用性（robust）良好的生物活性分析对于表征和监控产品活性至关重要，确保在存在变化的条件下依然能获得稳定的结果可以有效加速药物的开发、申报和上市。

2.1 质量源于设计（QbD）

质量源于设计（QbD）和试验设计（DoE）在生物活性分析中通常被用来研究方法的耐用性。DoE可以用来对API浓度、孵育时间、细胞密度、培养时间、显色方式等进行组合设计，但由于生物活性分析存在较大的变异性，通常对于一个条件需要进行重复试验以获得重复性（repeatability）和准确度（accuracy），其应用于方法验证的话则可能需要的试验次数太多。

而结合分析方法质量源于设计（AQbD）思维的DoE可以有效减少试验次数，从而在方法开发阶段通过设定符合质量研究目标和方法，通过RM分析影响分析方法可靠性的参数，采取降低风险的措施，设置合理的设计空间，并通过方法验证制定最终的控制空间。由于现实条件的限制，目前大多数的生物活性法方法开发中都很难执行真正有效的AQbD，但在方法开发中引入AQbD进行方法的耐用性考察和验证方案的设计对于方法的持续优化、验证和数据的可靠性都具有重要的意义。

2.2 统计学

在生物活性分析的参数选择和考察中，除了常规的分析方法重复性、准确度的计算外，统计学可以剂量效应曲线在相似性判断中起到重要的作用。如F-统计常用来判断斜率的相似性（参考文献3）。

近年来，USP中关于生物活性分析的章节1032、1033、1034正日益被用来指导生物活性分析的设计和开发。而在ChP 3531中，尼妥珠单抗生物学活性的测定中规定供试品和对照品的平行性假设需不被否定（P＞0.05）；在ChP 3535中，康柏西普相对结合活性的测定中规定标准品与待测样品的上渐进线（四参数曲线的D值）比值为0.80~1.25，下渐近线（四参数曲线的A值）比值为0.60~1.67之间，标准品与待测样品斜率（四参数曲线的B值）比值为0.80~1.25之间，前7个浓度点，两重复孔OD值CV%不大于15%，实验方为有效（参考文献3）。这些试验的可接受标准既代表了监管机构的强制要求，也要求我们在方法研究中尽可能地使用统计学根据以从大量随机性的数据中获得生物活性分析的规律。

3 生物活性分析验证

3.1 生物分析方法的偏差来源

在生物活性分析的方法验证中，多种因素导致的偏差会使方法验证工作进行的相当困难。如在常用的基于细胞的生物学活性分析方法研究中，包括以下因素都会导致偏差产生，如（参考文献1）：

细胞代次不同照成剂量效应曲线变化；

96孔板的边缘孔液体蒸发，即边缘效应；

96孔板中氧气和二氧化碳的交换；

细胞培养箱温场的不稳定性和不均匀性导致96孔板内产生温差；

样品制备、稀释过程中导致板内药物浓度不一致，如多通道移液器各孔道的不一致性，枪尖残液；

酶标仪读数的偏差等。

因此，在生物活性分析的开发中需要考虑到这些因素，确保使用的仪器设备处于受控的状态，从稀释的均匀性，移液的一致性，样品的排布进行综合考虑，如在96孔板内增加缓冲区以避免边缘孔的蒸发，加用湿盒保持饱和湿度，规定移液方式、梯度稀释混匀次数等多方面保证实验的一致性（参考文献4）。

3.2 生物活性分析的验证设计

生物活性分析的方法验证通常需要进行多次试验以获得足够的数据对方法的各项参数进行分析。为达到验证工作的合规性和工作量的合理性的平衡，除参考常规的分析方法验证指南外（如ChP 9101），通常可在方法验证中对除专属性以外的指标进行合并设计（准确度、精密度、线性和范围）。在ChP 9401中，分别对基于细胞的体外生物学活性和基于动物的体内生物学活性给出了示例（参考文献3）：

在人粒细胞刺激因子生物学活性测定法（NFS-60细胞/MTT比色法，ChP 3525）验证中，采取在对数尺度上呈均匀间隔的相对效价水平64%、80%、100%、125%、150%，每个效价水平由2名分析人员在不同日期使用4个细胞代次进行测定，通过合并设计得出相对准确度、中间精密度（重复性）、线性和范围指标。

考察的统计学参数包括相对准确度（相对偏倚应应不大于±12%并报告期置信区间上限，且理论效价值与测定值的对数线性拟合斜率应在0.80~1.25之间）、中间精密度每个测定值的几何变异系数（GCV）应不高于20%、线性（理论效价值与测定值的对数线性拟合相关系数应不低于0.98）、范围（报告相对准确度、中间精密度和线性符合要求时的效价水平范围，该范围应至少涵盖相对效价的质量标准80~150%）。

在卵泡刺激素生物活性分析（ChP 1216，大鼠卵巢增重法）中，同样对以上四项指标进行合并设计，选择在对数尺度上呈均匀间隔的80%、100%、125%，每个效价水平独立测试3次，四项指标参数与以上例子相同。

4 生物活性分析的生命周期管理

在验证完成后生物活性分析就可以开始使用，但仍需要对其性能进行持续的监控。最常用也是最简单的监控方法是选取适宜的参数进行统计过程控制（SPC）图进行检测，如标准品的剂量反应曲线和质控品、样品的效价测定值等（参考文献3）。通过SPC图可以有效识别到方法的漂移和波动，并应及时进行归因分析，95%置信区间（95%CI）也有助于对混杂的数据进行统计。

当药品的生产工艺变更、制剂组方变更等发生时，应评估这些变更对方法造成的修订和质量标准的改变，重新进行完整的方法验证或通过桥接将原始测定数据过度到修订方法。此外，对于已验证的方法发现其不适合设计的使用用途时，应及时开发更稳定的生物活性分析以避免监管机构对于产品性质的质疑。

5 小结

生物活性分析通常是生物药开发中的重要限制因素，需要在GXP的基本要求下，通过AQbD指导方法开发，通过RM识别方法的主要变异点，采用合适的统计学参数对结果进行分析和报告，并加强方法的生命周期管理，从而获得持续稳定的生物活性分析的数据，对于生物药的申报和上市都能产生很好的促进作用。

参考文献

1 Cheryl Scott, Laureen Little, Nadine Ritter and Michael Sadick. BioassayEvolution: Finding Best Practices for Biopharmaceutical Quality Systems.BioProcess Int. Janurary 2020.

2 Das RG, Robinson CJ. Assessing Nonparallelism in Bioassays: A Discussionfor Nonstatisticians. BioProcess Int. November 2008.

3 Chp 2020.

4 Neeley C. Reducing the Edge Effect. Accelerating Science 27 June 2016.