对于新手来说，含量方法学验证实验中的关注点要少于有关物质，并且定义和思路也更加容易理解。按照试验顺序细分为方法开发和方法验证，在这篇文章中，我们把方法开发这个模块涉及到的各项实验内容做以归纳总结，希望各位能够有所收获。

1.色谱条件的选择

其实含量的方法开发，相较于有关物质而言，要考虑的层面少了很多，也简单很多。

有关物质通常要对比各已有标准的方法，在杂质分离情况和检出能力后选取最优方法，而含量只需要关注主成分峰的专属性，选择一个更简单快捷省时省钱的方法即可（是的，还要想着点儿省钱），并不需要再去对比各方法——因为只要通过验证，就能够证明含量测定方法是准确的，在此基础上，并不存在谁比谁更加准确的概念。

因此，我们通常的做法是先去开发有关物质色谱条件，在该条件的基础上略加调整，再进行对照品溶液的紫外扫描，选择一个合适的检测波长，色谱条件就确定下来了。

2.样品配制方式的考察

一般情况下，主要考虑两个以下方面：用哪种溶剂可将主成分提取出来；用哪种方式可更好更快地用该溶剂将主成分提取出来（常见的方式有超声和振摇）。

溶剂的选择主要看主成分溶解性和制剂工艺。

主成分溶解性即选择适宜的溶剂，确保对照品溶液和供试品溶液溶解良好，首选流动相，或梯度程序中的初始比例流动相，或流动相中的纯有机相。

制剂工艺对样品含量测定配制方式的影响，具体情况有很多种，需具体分析和关注。例如：有些缓释片中含有大量缓释骨架材料及其他不溶性辅料，在配制中需要先加部分甲醇超声，使材料分散，再加其他溶剂稀释。如果没有先加甲醇等有机溶剂，缓释材料一经超声即聚集成团，把主成分包裹在里面造成无法被提取。

还有些微丸，颗粒非常紧实圆润，无法先研成细粉再测定含量。在这个时候，主成分提取是否完全，测定结果是否平行，更是含量方法开发中要重点关注的问题——笔者曾经让小姑娘尝试研磨过微丸，30分钟才能研成细粉，而且细粉的均匀度并不好，测定结果重复性差。并且，小姑娘半条胳膊已废，一晚上都很想哭——关爱小朋友，从我做起，从不把微丸研成细粉做起。

建议用含量测定的结果去衡量选择的配制方式是否合适。

3.样品处理方式的考察

这一项考察的是，可用哪种方式，在样品进行分析之前除去不溶性颗粒（过滤或者离心?）。仍然建议采用含量测定的结果为指标，考察样品不同处理方式对于测定结果的影响。值得关注的是，为确保后续试验准确无误，这一步不仅要考察不同类型滤膜是否有干扰，还要考察弃去不同初滤液体积的结果，有时离心的不同转速和时间也会对结果产生影响。每种方式推荐平行制备三份。

为逐一排除吸附原因，空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液均应考察滤膜干扰。

（1）空白溶剂考察过滤前后是否有影响主成分测定的杂峰产生；

（2）对照品溶液统计过滤前后的峰面积差异；

（3）供试品溶液采用外标法以峰面积计算待测成分的含量，选定的处理方式需确保供试品提取完全、且提取过程中未发生明显降解。

以表格形式，推荐试验方式如下：

4.其他

在方法开发中，很多细节的问题如果被忽略，将会导致方法验证的失败。在开发过程中，应有意关注色谱仪、色谱柱、流动相等因素的耐用性，应关注待测溶液的灵敏度。有时在正式的方法学验证之前，需进行几项必要的方法学预验证。

5.总结

摸索开发一个方法的过程，就像找一个聚会的好馆子一样，要从各个方面考虑。菜色要齐全，荤素要搭配，选餐馆的类别和方向要考虑人物特点。如果约刚认识的女朋友，就别去甩开膀子喝酒的大排档；如果约钢铁直男谈天地，就别去文艺昏暗的西餐厅。