1. 色谱柱使用寿命

问：我的色谱柱仅进样了100针，就出现色谱峰变形、柱效下降，这是为什么？

答：仅进样100针确实是很短的柱寿命。正常情况下，一根色谱柱是可以使用更长时间的。为了确定是哪里出了问题，我们首先需要确定是否只要你采用该分析方法，柱寿命就是很短。

有两种基本情况：

1.     以前有用于该分析方法的色谱柱，其使用寿命都要长的多；

2.     所用用于该分析方法的色谱柱，在使用大致相同的进样针数后就报废了。

在第一种情况下，我们需考虑所用分析方法是否真的保持一致。样品的组成有没有改变？样品中的强保留杂质会使柱效降低。所用仪器通路中的密封件状态是否完好？脱落的密封件碎屑可能堵塞柱筛板和柱头处的填料，从而影响样品的分配。

如果能合理的确定色谱条件没有变化，那么你可以认为问题的原因是填料床的机械性缺陷。这可能是由于实验室使用中或运输过程中对色谱柱的粗暴处理引起的（您将其掉落了吗？），或者是由于制造缺陷引起。此类缺陷无法通过标准色谱柱质量控制检测出来，只有在使用一段时间后才能显示出来。针对后一种情况，色谱柱生产厂家将会为您免费更换色谱柱。

问: 这些色谱柱生产厂家很好，但这不是我的问题。我的色谱柱使用寿命总是很短，有时是进样100针，有时是200针。我可以忍受200次针的使用寿命，但100针的使用寿命是不够的。而且色谱柱价格越来越昂贵。我应该怎么办？

答：我100％同意你的看法。我们需要做的就是一起找到导致问题的原因，然后看看可以采取什么措施来解决它。

造成上述问题最可能的原因是样品组分被吸附在了色谱柱柱头部分。它们可能是由于在流动相中的低溶解性而析出沉淀，或是被主动强吸附。随着您进样次数增多，这些污染物会堆积在色谱柱的顶部，阻碍样品的正常吸附和分布，从而导致峰形变差。通常，这个问题通常还伴随着系统压力的增高。

问：好的，可能就是如此。那我应该如何解决呢？

答：有几种方法可以防止这种情况的发生。一种是使用合适的样品制备技术来净化样品。使用与分离柱化学性质相似的SPE柱进行固相萃取可很好地解决此问题。

另一种也是更有力的方法是使用保护柱。当发生上述问题时，预柱就代替了被牺牲的柱头。为了获得最佳性能，您应使用与分析柱有完全相同填料、并采用了相同高性能填料技术的保护柱。如果使用其他品牌填料的预柱，则在分离效能和保护分析柱方面都无法达到最佳。另外，请勿使用更大粒径的预柱，大粒径或填充不好的预柱可能由于预柱中谱带变宽导致分离效能下降。

问：使用预柱听起来不错。你还有其他解决办法吗？

答：嗯..也不是能说没有，还有其他几种，但他们各有各的缺点。

我不主张使用理论上能溶解色谱柱顶部污染物的溶剂进行色谱柱“洗涤”。在许多情况下，这根本行不通。例如，如果污染物是沉淀在色谱柱头部的蛋白质，那么当您尝试将其洗掉时，它们已经因变性而大量老化，甚至发生交联以致无法再次溶解。此外，每次冲洗还会带走水解的键合相，如果不冲洗该键合相应该是在发生水解的位置处保持局部平衡的。因此，重复清洗实际上可能导致色谱柱的加速老化。还有，每次冲洗后你还需要用流动相对色谱柱进行再平衡，再平衡过程在部分情况下将会非常耗时，如使用离子对色谱法。

经常尝试的另一种方法是反冲色谱柱。如果使用与流动相不同的溶剂进行冲洗，那么我们反对的理由就与色谱柱冲洗一样。如果使用流动相冲洗，那么就会花大量时间直到污染物被冲洗出来，也可能甚至根本就冲洗不出来。同样，任何的反冲都会伤害色谱柱。即使今天的色谱柱被填充的足够好，可以承受反冲，我仍不建议将其作为标准操作。

问：所以你给出的最好建议就是使用预柱？

答：完全正确。使用预柱花费不大——根据品牌和类型不同，价格在$10~$50之间——而他们保护的色谱柱价格通常是其价格的10倍。此外，它们还可以保护您的色谱柱免受其他可能更难追查污染物的侵害。你所提到的色谱柱问题的根源还可能是由其他污染物如流动相中的灰尘或泵密封垫脱落的碎屑引起。也可能是由流动相中的污染物被吸附引起。上述原因中的其中一些可能很难进行故障排查，而保护柱可以很容易的解决这些问题。

问：还有其他原因可能导致色谱柱寿命缩短吗？

答：有，但是如果您遵循制造商的建议，则可能性很小。一种可能的原因是由于流动相pH值超出建议范围而导致色谱柱塌陷。这也可能因样品溶解在强酸或强碱溶液中引起的。

此外，针对特定色谱柱，这里还有一些小建议。

例如氨基柱会与醛和酮反应。在无缓冲盐的水溶液中的氨基柱会产生强碱性的pH值，从而导致二氧化硅部分溶解。

当暴露在错误的溶剂中时，色谱柱也会塌陷。这是因为色谱柱从根本上来说结构非常松散。它们通过颗粒彼此粘附而部分聚集在一起。当你将它们置于破坏这种粘附力的流动相中时，柱床塌陷的可能性就会增加。这偶尔会发生于在中等极性溶剂中的CN柱或在THF溶剂中的苯基柱上。

这也是避免色谱柱“洗涤”的一个原因。

2. 不断变化的保留时间

问：我的色谱峰保留时间不固定，这是为什么？

答：首先，我们需要找到这种变化的模式。这将告诉我们很多有关该问题的潜在根源。如果保留时间从一次运行到下一次运行随机变化，那么我将首先检查一下泵和溶剂混合装置。为验证泵是否正常工作，请使用带刻度的量筒和秒表来测量流速。为了验证流动相的组成有无变化，可以向一种流动相溶剂中加入示踪剂然后观察基线。如果流动相组成恒定，则基线将稳定。如果成分发生变化，您将在基线中观察到相应的变化。例如，如果您使用的是带紫外检测器的反相色谱法，你可以向有机溶剂中添加0.1％丙酮，并在254 nm处监测基线。或者，您可以手动配置流动相从而绕过溶剂混合设备。如果保留时间的波动消失了，那么问题的根源就是混合设备。

问：同一天不同针之间的保留时间很稳定，但是不同天之间的保留时间不固定。

答：在这种情况下，仪器本身不太可能是罪魁祸首。引起这种变化的最可能原因是流动相组成。在反相色谱中，保留因子k与流动相中有机溶剂的体积分数之间存在指数关系。根据经验，如果有机溶剂的用量误差为1％，则保留时间可在5％至15％之间变化，通常约为10％。这意味着您必须非常仔细地测量溶剂的量。最好的方法是按重量而不是按体积制备流动相。

另外，如何给流动相脱气也可能导致保留时间变化。最好的脱气方法是同时采用真空和超声约一分钟。另一种好的方法是氦气吹扫。在流动相与氦气达到初步平衡后，应将氦气流量调低。否则，氦气将携带溶剂蒸气，而流动相溶剂组成可能会因此蒸发而发生变化。

如果您的样品成分是离子型或可离子化的，那么控制流动相的pH值就非常重要。小至0.1pH单位的变化都可能导致保留时间10％的偏移。因此，准确测量pH值并维持pH计校准良好非常重要。在反相系统中，随着pH值的增加，酸的保留时间缩短，而碱的保留时间延长。

顺便说一句，我的化学老师总是说：“缓冲液之所以称为缓冲液，是因为它应该缓冲pH值。如果不这样做，就不是缓冲液。”例如，乙酸铵溶液就是乙酸铵溶液。乙酸盐缓冲液包含乙酸根离子和乙酸。如果缓冲液中它们的存在量相同，则所得的pH值就是缓冲液的pKa值，以乙酸盐为例其pKa值为4.75。缓冲液总是在溶液pH=pKa时，缓冲能力最强。

问：过去，我没有意识到需要多么精确地控制流动相组成才能获得可重现的结果。还有其他必须注意的变量吗？

答：另一个重要因素是温度。如果所有峰的保留时间沿同一方向移动，你就可以怀疑是温度是引起这种波动的原因。经验告诉我们，温度每变化每1摄氏度，保留时间将变化约1％至2％。在正常情况下，这变化并不显著。但在许多地方，周末会关闭暖气或空调，然后你就会疑惑为什么在周末自动运行的分析显示的保留时间与在工作日时运行的分析的保留时间不同。显然，通过使用柱温箱可有效避免这种情况发生。

在检测离子型或可电离样品化合物的反相色谱法中，保留时间还受到缓冲液离子强度的影响，但影响很小，通常可以忽略不计。通常20％摩尔浓度的缓冲液变化对保留时间的影响在在1％以下。因为总是对缓冲盐进行称重后配置缓冲液，因此不可能发生如此大的错误。

问：还有需要考虑其他参数的特殊情况吗？

答：是的。在离子对色谱中，离子对试剂的浓度会影响离子样品组分的保留。与离子对试剂带相反电荷的分析物的保留时间增加，带相同电荷的分析物的保留时间减少。中性化合物几乎不受影响。当离子对试剂浓度低时，即低于5 mM/L，与试剂相互作用的样品成分的保留时间会随离子对试剂浓度的变化成比例地变化。当离子对试剂浓度高时，即大约10 mM/L，基团表面被离子对试剂吸附饱和，此时离子对试剂浓度的变化不会导致分析物的保留时间发生明显变化。

在正相色谱中，保留时间对流动相中极性成分的浓度非常敏感。无论是否想要，这些成分中总是存在的一种是水。因此，水分含量的不同就可能导致保留时间的不同。解决该问题的一种诀窍是使用用水半饱和过的非极性溶剂，如己烷或二氯甲烷。为此，您需要取一定量的此溶剂并通过向其中添加一些水再搅拌一会儿使其饱和，，然后将这种水饱和的溶剂混匀后与等体积的“干燥”溶剂混合。该么操作的结果是非极性溶剂的水含量具有相当好的重现性。它还有助于防止保留时间的漂移，但这是后面部分的主题。