概述

     2021年4 月 29 日，EDQM 宣布叠氮杂质是一种新的致突变物质。2021年6月，加拿大卫生当局，发布消息，赛诺菲-安万特加拿大公司因叠氮杂质而召回 12 批厄贝沙坦药物（商品名 Avalide 和 Avapro，涉及不同剂量），因为测试发现叠氮基杂质超过了可接受的限度。

      叠氮类化合物（结构见图1）是医药行业中常用的化工原料，例如在抗高血压药物厄贝沙坦的合成中，通常需要使用三丁基叠氮化锡或叠氮化钠以形成药物结构中的四唑环；抗癌药卡莫氟的制备中需要以叠氮化钠和庚酰氯合成中间体异氰酸乙酯。由于该类化合物能够抑制细胞色素氧化酶以及多种酶的活性，并导致磷酸化及细胞呼吸的异常，引起血管张力极度降低；损害生物细胞，阻碍生物的新陈代谢；在较低浓度水平时也可能会直接引起DNA损伤，导致DNA的诱变，从而引发癌症，叠氮化物应根据人用药物注册技术要求国际协调会 (ICH)-M7指导原则作为致遗传突变杂质进行控制，因此在药物生产过程中，必须严格控制药物和医药中间体中叠氮化物的含量.

      对药物中叠氮化物的分析检测已成为目前基因毒性杂质研究的重要话题之一，因此建立快速、灵敏、准确、可靠的叠氮离子分析方法十分必要。

      根据参考各国药典及文献，总结了部分含有叠氮类化合物类基因毒杂质药物的种类，详见表1。

常用的检测方法

直接检测法：

      目前叠氮类化合物的检测方法较多，文献报道的叠氮化物分析方法有容量分析法、紫外分光光谱分析法、GC法、GC-MS法、HPLC法、LC-MS法和离子色谱法（IC）等。其中容量分析法和分光光谱分析法在测定低浓度叠氮化物时不够准确，很少用到。GC法和HPLC法要求对样品进行特定的预处理，但也有文献报道，使用HPLC-UV可直接测定沙坦类药物中叠氮化物的残留。目前USP规定的用于测定叠氮化物的最广泛使用的方法是离子色谱法（IC），该法因其灵敏度高、选择性好，快速方便的特点，成为近年检测叠氮根的主要手段。根据文献报道，离子色谱法应用于叠氮化物的检测分为采用碳酸钠洗脱系统的IC法和免化学试剂离子色谱分析法（RFIC），后者灵敏度高，选择性好，已被广泛应用于原料药中叠氮化物的检测。

衍生化法：

      当样品不能直接进样分析时，为了满足分析方法的要求，同时也能够提高叠氮化物的检测灵敏度，通常会选择柱前或柱后衍生的方法进行检测。据文献报道，可使用五氟苄基溴（PFBB）作为衍生化试剂，生成五氟苄基叠氮化物（PFB-Az）衍生物，然后采用反相HPLC-UV法检测该衍生化产物即可测定原料药中叠氮化物。除此之外，也有文献报道采用丙酸酐或苯甲酰氯作为衍生化试剂生成酰基叠氮化物，使用配备有氮磷检测器的HS-GC，在GC的加热进样器中，衍生物丙酰叠氮化物进行热重排形成异氰酸乙酯，随后对其进行色谱分离和检测，从而测定样品中的叠氮化物，该方法灵敏度极高，对叠氮化钠的定量限为0.04 µg / mL目前已被广泛应用。

案例

厄贝沙坦：

      厄贝沙坦（Irbesartan，化合物1，图2）是一种血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，主要用于高血压的治疗，减缓糖尿病肾病的发展等。在厄贝沙坦的合成工艺（图2）中，中间体5与叠氮化钠反应制得厄贝沙坦，而叠氮化钠可能残留于厄贝沙坦成品中，因此必须进行严格控制。根据ICH发布基因毒性杂质的最大摄取量为1.5 μg/d计算，厄贝沙坦的最大日剂用量为300 mg，则对应的基因毒性杂质叠氮化钠的TTC水平为5 ppm。

      因此，采用免化学试剂离子色谱分析法（RFIC）测定叠氮化钠。根据ICH指南要求，对该方法进行了检测限（LOD）、定量限（LOQ）、线性、精密度、准确性等相关验证，叠氮化钠在0.003~0.240 μg/mL的范围内成良好的线性关系，相关系数R2=0.9995，叠氮化钠的LOD和LOQ分别能够达到0.0008 μg/mL及0.0029 μg/mL，平均回收率为100.26 %，本法灵敏、可靠、简便、操作简单且无机制干扰，适合在痕量水平下对厄贝沙坦中基因毒杂质进行控制，为厄贝沙坦工艺过程控制和质量保障提供参考依据。

头孢孟多酯钠:

      头孢孟多酯钠（Cemandil sodium salt，化合物6，图3）是一种杀菌作用强的第2代半合成头孢菌素。头孢孟多酯钠的合成工艺中以7-氨基头孢烷酸（7-ACA）和1-甲基-5-巯基-1,2,3,4-四氮唑为起始原料生成中间体7，经过硅化反应和酰化反应生成头孢孟多酸（中间体9），再与异辛酸钠成盐得到头孢孟多酯钠。其中起始原料1-甲基-5-巯基-1,2,3,4-四氮唑的合成需要异硫氰酸甲酯和叠氮化钠，依据EMA和FDA相应的指导原则，有必要对头孢孟多酯钠中的叠氮化钠的残留进行定量分析。根据ICH发布基因毒性杂质的最大摄取量为1.5 μg/d计算，头孢孟多酯钠最大日剂用量4 g，则对应的基因毒性杂质叠氮化钠的TTC水平为0.375 ppm。

      因此，采用HPLC直接检测的方法对叠氮化钠进行定量，在该方法下LOQ为0.4 ppm，LOD 为0.2 ppm，在0.4~3.0 ppm的浓度范围内均成良好的线性关系，相关系数R2=0.9997，回收率为92.7-102.3%。该方法快速、简单、准确且经全面验证后符合检测的需求。

总结

      叠氮类化合物作为基因毒性杂质，通常作为起始物料、反应试剂或中间体存在于药物合成过程中，这些物料可能会残留于终产品中成为杂质，叠氮化物属于剧毒物质，可引起中毒死亡。因此，药品中如果含有叠氮化物残留，药品就会存在质量缺陷并对人类健康造成威胁，建立快速、灵敏、准确、可靠的分析方法以控制药物中叠氮化物含量就显得尤为重要。

      随着基因毒性杂质法规逐步健全，药政官方对基因毒性杂质的监管要求日益增高。近些年，在产品的上市申请中，由基因毒性杂质控制不合规导致的药品质量缺陷越来越多，对消费者身体健康造成不可忽视的威胁，充分的基因毒性杂质研究已经成为产品能否上市的关键。因此，如何选择最优的基毒杂质控制策略，以维持基毒杂质的危害最小化和企业开发药品成本之间的平衡，已成为当下药品生产企业必须面对的命题

本文根据以下文章进行编辑整理，仅用于学习、交流：.

1. Maja Griˇcar，Samo Andrenˇsek．Determination of azide impurity in sartans usingreversed-phase HPLC with UV detection．Journal of Pharmaceutical and BiomedicalAnalysis  (2016) , 125, 27–32.

2. 李美君，姚先珍，汪秀林，王善斌，离子色谱法测定厄贝沙坦中叠氮化物，(2012), 9(32) , 239-240 , 118-124

3. 岑均达，马霞，厄贝沙坦的合成，Chinese Journal of Pharmaceuticals  (2007), 38(3) , 239-240.

4. 张文生，胡文滨，夏建超，头孢孟多酯钠的合成，(2012), 35(10) , 27–30.