本文主要介绍了湖南莱拓福生物科技有限公司研发的医疗器械“醛酮还原酶 1B10 测定试剂盒 （时间分辨荧光免疫分析法）”的临床前研发实验。

一、醛酮还原酶 1B10 测定试剂盒 （时间分辨荧光免疫分析法）的产品主要组成成分

本检测试剂由校准品（6瓶/组）、生物素标记物、铕标记物、浓缩洗液、生物素标记物缓冲液、铕标记物缓冲液、包被酶标板、增强液、校准品稀释液、封片、自封袋组成。 其中包被酶标板上包被有兔抗AKR1B10多克隆抗体，生物素标记物为生物素标记鼠抗AKR1B10单克隆抗体。

二、醛酮还原酶 1B10 测定试剂盒 （时间分辨荧光免疫分析法）的产品预期用途

用于体外定量检测人血清中AKR1B10的含量。临床主要用于对确诊且术前AKR1B10阳性的原发性肝细胞肝癌手术患者进行动态监测以辅助判断疾病进程或手术治疗效果，不能作为原发性肝细胞肝癌早期诊断或确诊的依据，不用于普通人群的肿瘤筛查。

三、醛酮还原酶 1B10 测定试剂盒 （时间分辨荧光免疫分析法）的产品包装规格

96人份/盒。 

四、醛酮还原酶 1B10 测定试剂盒 （时间分辨荧光免疫分析法）的产品检验原理

试剂盒采用双抗体夹心时间分辨荧光免疫分析法 （IFMA法）定量检测人血清中AKR1B10蛋白浓度。以兔抗AKR1B10多克隆抗体包被反应板，用生物素（Biotin）标记鼠抗AKR1B10单克隆抗体做检测抗体，用铕标记链霉亲和素（Streptavidin-Eu）作为发光标记物。 

检测时，将待测样本加入反应板微孔，样本中的AKR1B10与包被于微孔表面的兔抗AKR1B10多克隆抗体结合。洗涤后，加入生物素标记鼠抗AKR1B10单克隆抗体，鼠抗AKR1B10单克隆抗体与结合在反应板上的AKR1B10蛋白结合，洗涤后，加入铕标记链霉亲和素，铕标记链霉亲和素与结合在反应板上的鼠抗AKR1B10单克隆抗体上标记的生物素反应，在微孔表面形成免疫复合物：兔抗AKR1B10多克 

隆抗体-AKR1B10蛋白-鼠抗AKR1B10单克隆抗体-Biotin Streptavidin-Eu。洗涤除去游离的铕标记链霉亲和素，加入增强液将复合物上的Eu3+解离到溶液中，并与增强液中的有效成份形成高荧光强度的螯合物，其荧光强度与样本中的 AKR1B10蛋白浓度成正比。通过剂量-反应标准曲线得出样 本AKR1B10浓度值。 

五、醛酮还原酶 1B10 测定试剂盒 （时间分辨荧光免疫分析法）的主要原材料的选择

本产品的主要原材料包括：铕标记链霉亲和素、醛酮还原酶1B10（AKR1B10）抗原、兔抗AKR1B10多克隆抗体、生物素标记鼠抗AKR1B10单克隆抗体，其中醛酮还原酶1B10抗原、兔抗AKR1B10多克隆抗体、生物素标记鼠抗AKR1B10单 克隆抗体为 莱拓福自行研制生产，其余原材料均为外购方式获得。 莱拓福选择有资质的供应商提供的原料，通过功能性试验，筛选出最佳原材料和合格供应商，并制定了各主要原 材料的技术要求和质量标准并经检验合格。

六、醛酮还原酶 1B10 测定试剂盒 （时间分辨荧光免疫分析法）的企业参考品设置情况

莱拓福设计了完整的企业参考品，包括线性参考品、空白限参考品、重复性参考品、准确度参考品、特异性参考品。 

具体如下： 

线性参考品1份，为临床阳性样本，经添加稀释的AKR1B10抗原溶液制备而成，浓度为5700~6000pg/mL。 

空白限参考品1份，为校准品稀释液。 

重复性参考品2份，为临床阳性样本，经添加稀释的AKR1B10抗原溶液制备而成，浓度分别为1800~2200pg/mL 和900~1100pg/mL。 

准确度参考品2份，为临床阳性样本，经添加稀释的AKR1B10抗原溶液制备而成，浓度分别为4000~5000pg/mL 和0~500pg/mL。 

特异性参考品2份，为市售的AFP、CEA抗原，用稀释缓冲 液 稀 释 制 备 而 成 ， AFP 特 异 性 参 考 品 浓 度 为1000±100ng/mL，CEA特异性参考品浓度为100±10ng/mL。 

七、醛酮还原酶 1B10 测定试剂盒 （时间分辨荧光免疫分析法）的生产工艺及反应体系研究

莱拓福通过对试剂主要生产工艺的研究，确定了最佳生产工艺。 莱拓福对反应体系研究包括样本要求、样本用量、试剂用量、各检测步骤的反应时间、洗涤次数等，通过一系列研究，最终确定了最佳的反应体系。通过10份不同浓度的AKR1B10阳性血清样本体外37℃模拟实验研究确定，标志物的半衰期为22.3h。 

八、醛酮还原酶 1B10 测定试剂盒 （时间分辨荧光免疫分析法）的产品分析性能评估

本产品分析性能评估内容包括外观、线性、空白限、精密度、准确度、特异性、干扰因素的评估等。 莱拓福提交了三批产品在适用机型上的性能评估资料。在线性性能评估中， 莱拓福对线性参考品与低值血清或生理盐水等比稀释6个浓度水平的样本进行检测，结果显示 

本产品在105pg/mL~6000pg/mL范围内，线性相关系数r不低于0.9900，符合要求。在空白限性能评估中， 莱拓福对空白限参考品重复测定20次，计算浓度值，最终确定并验证本试剂盒的空白限为100pg/mL。 在精密度性能评估中， 莱拓福对不同浓度的参考品（含 

高值、低值和cutoff值附近浓度值）进行检测，分别评估了批内、批间、室内、室间、日内、日间、不同操作者、不同仪器之间的精密度。结果显示：检测结果的变异系数（CV值）均不高于10.0%，表明本产品的批内、批间、室内、室间、日内、日间、不同操作者、不同仪器之间的重复性均符合要求。在准确度性能评估中， 莱拓福对准确度参考品（含高值和低值两个浓度水平）按比例混合，进行检测，计算回收率， 符合要求。 

在特异性性能评估中， 莱拓福对两个特异性参考品进行检测，结果显示检测结果均不高于100pg/mL，符合要求。在干扰因素的性能评估中， 莱拓福对常见干扰物质（溶血、脂血、黄疸、生物素）、自身免疫性抗体（类风湿因子、抗核抗体、人抗鼠抗体）、结构相似的蛋白（AKR1B1）、常见抗肿瘤药物（索拉非尼、奥沙利铂、表柔比星）、常见解热抗炎药物（阿司匹林）、常见病原体（乙型肝炎表面抗原）、肝部异常常规检测相关生物标志物（甲胎蛋白）、肠道异常常规检测相关生物标志物（癌胚抗原、糖类抗原19-9）等进 

行了研究。 

结果显示：低于表1中浓度指标的干扰物质不会对本产品的检测结果产生干扰；抗核抗体ANA不影响实验结果；人抗鼠抗体（HAMA）、类风湿因子（RF）对本产品有干扰。

九、醛酮还原酶 1B10 测定试剂盒 （时间分辨荧光免疫分析法）的阳性判断值研究

莱拓福采用ROC曲线法确定阳性判断值。 莱拓福用本产品对107例临床病理确诊为原发性肝细胞肝癌患者术前血清标本和447例健康人血清标本，30例乙型肝炎标本，30例其他肝部良性疾病标本，30例肝硬化标本，30例转移性肝癌标本，进行检测，采用受试者工作特征（ROC）曲线方法确定临界值（cutoff）为215pg/mL。 

 莱拓福另对201例健康人血清样本进行检测，其检测数据呈偏态分布，血清AKR1B10检测结果P95为213.225 pg/mL，经四舍五入后确定95%＜213 pg/mL。

十、醛酮还原酶 1B10 测定试剂盒 （时间分辨荧光免疫分析法）的稳定性研究 

莱拓福对本产品的实时稳定性、开封稳定性等进行了研究，确定了各种条件下本产品的有效保存时间；同时对不同温度储存条件下临床样本储存稳定性及冻融稳定性进行了研究，确定了各种储存条件下临床样本的有效保存时间及冻 

融次数。 

产品实时稳定性研究：采用三批试剂进行研究，试剂保存在2~8℃条件下，分别保存0、1、2、3、6、9、11、12、13、 14个月时取出，对试剂盒外观、线性、空白限、重复性、准确度和特异性进行考察，各项性能指标均符合要求。因此确定申报产品的效期稳定性为：2~8℃保存，有效期为12个月。 

样本稳定性：采用10个不同浓度的临床血清样本分别放置在-80℃、-20℃、2~8℃、20~25℃条件下存放一定时间后取出，用本产品检测样本中AKR1B10浓度，与血清初浓度相比较，看浓度是否发生明显变化，以确定在对应温度储存条件下的样本稳定性，结果显示：血清样品在20~25℃环境下可以保存8小时，在2～8℃环境下可以保存7天；如果需要长期保存，则建议在-80℃或-20℃环境下保存（-20℃环境下可以 保存12个月）。