本文主要介绍了北京热景生物技术股份有限公司研发的医疗器械“乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）测定试剂盒（PCR-荧光探针法）”的临床前研发实验。

一、乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）测定试剂盒（PCR-荧光探针法）产品的主要组成成分

本试剂盒由A盒（磁珠法核酸提取试剂）和B盒（扩增反应试剂）组成，主要组成成分见表1。

表1 试剂盒主要组成成分

具体内容详见产品说明书。 

二、乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）测定试剂盒（PCR-荧光探针法）产品的预期用途

本试剂盒用于体外定量测定人血清样本中的乙型肝炎病毒RNA（HBV-RNA）。已有研究数据显示，外周血血清中 HBV-RNA 可反映肝内HBV病毒的转录活性，在部分血清中HBV DNA 低于检测下限的样本中，HBV-RNA 仍可以被检测到。同时，在NAs治疗中，血清HBV-RNA可辅助作为HBeAg转阴的预测的指标之一，血清HBV-RNA结果为阴性，需要结合其他指标共同用于指导NAs的治疗。该检测结果不得作为患者病情评价的唯一指标，必须结合患者临床表现和其他实验室检测对病情进行综合分析。本试剂盒不得用于HBV的血液筛查。

三、乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）测定试剂盒（PCR-荧光探针法）产品的产品包装规格 

48人份/盒。

四、乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）测定试剂盒（PCR-荧光探针法）产品的检验原理

本试剂盒（PCR-荧光探针法）采用磁珠法提取血清中的HBV-RNA。特异性地检测 HBV-RNA的保守区域。检测试剂内含有一条反转录引物、一对特异性扩增引物以及一条荧光探针，与RT-PCR反应缓冲液，Taq酶，逆转录酶等共同配制成RT-PCR反应液，在实时荧光定量 PCR 仪上进行一步法RT-PCR扩增，实现对血清样本中 HBV-RNA的检测。

五、乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）测定试剂盒（PCR-荧光探针法）产品的主要原材料的选择

本产品的主要原材料包括：引物、探针、假病毒、RT PCR反应体系（包括10×RT-PCR Buffer（含dNTPs）、逆转录酶和TaqDNA聚合酶混合液）、磁珠法核酸提取试剂等，这些原材料均是通过外购方式获得。其中，引物和探针均为热景生物自行设计，由专业的合成公司合成和纯化后获得。 

热景生物从有资质的供应商中，通过功能性试验，筛选出最佳原材料和供应商。制定了各主要原材料质量标准并经检验合格。

六、乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）测定试剂盒（PCR-荧光探针法）产品的企业参考品设置情况

该产品企业参考品包括阳性参考品、阴性参考品、精密度参考品、检出限参考品、准确度参考品、样本线性参考品、核酸提取功能参考品，参考品采用临床样本制备而成。

组成如下：

阳性参考品共10份，分别命名为阳性参考品P1~P10，来源于HBV-RNA阳性样本，涵盖B型、C型和D型。

阴性参考品共10份，分别命名为阴性参考品N1~N10，涵盖正常人样本、巨细胞病毒、EB病毒、人类免疫缺陷病毒1型、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和梅毒样本。

精密度参考品共2份，分别命名为精密度参考品J1~J2，采用HBV-RNA阳性样本梯度稀释而成。

检出限参考品1份，命名为检出限参考品S1，采用HBV RNA阳性样本稀释而成，浓度为300copies/mL 。

准确度参考品共5份，分别命名为准确度参考品Y1~Y5，采用HBV-RNA阳性样本梯度稀释而成，浓度分别为2.0×107 copies/mL、2.0×106 copies/mL、2.0×105 copies/mL、2.0×104 copies/mL、2.0×103 copies/mL。 

样本线性参考品1份，命名为样本线性参考品L，采用HBV-RNA阳性样本稀释而成。

核酸提取功能参考品共 12 份，分别命名为核酸提取功能参考品T1~T12，其中T1~T8采用含内源性干扰物质的HBV RNA阳性样本稀释而成，T1、T5、T9含血红蛋白，T2、T6、T10含甘油三脂，T3、T7、T11含总IgG，T4、T8、T12含总胆红素，T9~T12为阴性血清样本。

以上临床样本采用数字PCR法和实时荧光PCR法进行确认。各企业参考品用于产品准确性、特异性、检出限、精密度、线性、核酸提取功能等的检测。

本试剂盒设置了阳性质控品和阴性质控品，用于检测过程中试剂盒和仪器的质量控制。此外，每个样本均检测1个内标，用于评估核酸提取和PCR扩增的质量和结果的判读。

七、乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）测定试剂盒（PCR-荧光探针法）产品的生产工艺及反应体系研究 

热景生物对试剂盒反应体系的研究包括对HBV-RNA特异性引物/探针浓度的确定、内标引物/探针浓度的确定、反应液的选择、反应体积的确定、核酸提取试剂的确定、DNA酶I的用量确定等；对反应条件的研究包括PCR退火温度、扩增循环数、扩增反应时间，DNA 酶 I 的作用温度和时间的筛选和优化；对样本用量、内标用量、核酸提取液体积等进行了研究。

热景生物通过功能性实验，确定了最佳的反应体系。并根据试剂盒中试剂及组件的主要生产工艺的研究结果，确定了最佳的生产工艺。

八、乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）测定试剂盒（PCR-荧光探针法）产品的的分析性能评估研究

该产品分析性能评估内容包括核酸提取功能、检出限、线性范围、准确度、精密度、分析特异性（交叉反应、干扰物质）、HBV DNA 干扰浓度等。热景生物提交了有效运行的质量管理体系下生产的三批产品在3种适用机型（ABI Prism7500、LightCycler480、杭州博日 9600plus）上的性能评估资料。

在核酸提取功能评估中，热景生物使用含有28mg/dL总胆红素、22g/dL血红蛋白、3000mg/dL甘油三酯、40g/L总IgG的HBV-RNA阴性血清样本稀释已知浓度的HBV-RNA强阳性样本，制备成高、低浓度样本进行研究，结果表明以上干 

扰物质对核酸提取性能无影响。

在检出限的性能评估中，热景生物对HBV-RNA临床血清样本（B型、C型、D型）和HBV-RNA假病毒样本（A型、E型、F型、G型）进行梯度稀释，采用三批次试剂对系列浓度样本分别进行20次重复检测，以≥95%阳性检出率的最低稀释浓度作为检出限，最终确定该产品检出限为300copies/mL。采用三批试剂对HBV-RNA临床血清样本（B型、C型、D型）和HBV-RNA假病毒样本（A型、E型、F型、G型）进行检出限的重复性检测验证，符合检出限的性能要求。

在线性范围的性能评估中，热景生物采用不同基因型的样本，分别制备9个浓度的样本进行线性范围研究，产品在1.0×103 copies/mL~1.0×108 copies/mL范围浓度呈线性相关，线性相关系数 r＞0.9800，符合线性范围的性能要求。

在准确度的性能评估中，热景生物采用 HBV-RNA 阴性样本 

对阳性样本进行系列稀释，分别制备成2.0×107 copies/mL、2.0 × 106 copies/mL、2.0 × 105 copies/mL、2.0 × 104 copies/mL、2.0×103 copies/mL共5个梯度样本进行准确度研究，结果表明检测浓度的对数值与理论浓度的对数值的绝对偏差不超过±0.5 个对数数量级，符合准确度的性能要求。

在精密度的性能评估中，热景生物对高、中2个浓度的HBV RNA精密度样本进行检测，分别对批内、批间检测结果进行分析，结果表明精密度样本的变异系数均不高于5%，符合精密度的性能要求。

分析特异性研究包含交叉反应和干扰研究。交叉反应的性能评估中，热景生物对人巨细胞病毒、EB 病毒、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、梅毒、人类疱疹病毒 6 型、单纯疱疹病毒 1 型、单纯疱疹病毒 2 型、甲型流 

感病毒、丙酸痤疮杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌样本进行交叉反应评价。结果显示，上述样本与本产品均不产生交叉反应。

干扰研究实验中，热景生物采用在中低浓度的 HBV-RNA 样 本中加入干扰物质的方法进行验证，拉米夫定（1.3μg/mL）、 阿德福韦酯（21.24ng/mL）、恩替卡韦（3.46μg/mL）、替比夫定（3.69μg/mL）、普通 IFNα（2020pg/mL）、聚乙二醇干扰素α（10.88μg/L）、总胆红素（≤28mg/dL）、甘油三酯（≤3000mg/dL）、血红蛋白（≤22g/dL）、总 IgG（≤40g/L）及不高于 2×107 IU/mL 的 HBV DNA 对本产品检测结果均不产生干扰。

九、乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）测定试剂盒（PCR-荧光探针法）产品的阳性判断值或参考区间研究

本产品的阳性判断值研究，采用乙肝感染者的血清样本（B 型、C 型、D 型）及不同人的阴性血清样本共 249 例，使用本试剂盒进行阳性判断值研究，对检测靶标 Ct 值进行ROC 分析，确定其阳性判断值为靶标 Ct≤26。通过对 HBV DNA 阳性/阴性、HBsAg 阳性/阴性及 HBeAg 阳性/阴性样本的 靶标进行 Ct 值分析，HBV DNA 阳性/阴性、HBsAg 阳性/阴性 及 HBeAg 阳性/阴性对靶标阳性判断值的判定无影响。

本产品预测HBeAg转阴的阳性判断值研究，采用79例慢性HBV感染者（B型、C型、D型）队列血清样本（0周、48周、5年），使用本试剂盒进行检测，对检测结果分别计算 B、C、D 型的 ROC 曲线和最佳预测 cutoff 值，结果显示 

均不具有显著差异；将 B 型、C 型、D 型样本合并共同用于确定预测治疗 5 年后 e 抗原转阴的最佳 cutoff 值为708copies/mL。此时的 PPV 为 81.8%，NPV 为 87.0%。

十、乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）测定试剂盒（PCR-荧光探针法）产品的稳定性研究

热景生物对本产品的实时稳定性、开瓶及冻融次数限度稳定性、运输稳定性进行了研究，同时，对样本的稳定性也进行了研究，确定了在各种条件下本产品及样本的有效保存时间。

实时稳定性：将三批次试剂的 A 盒置于 10~30℃，B 盒置于-20 ± 5℃的条件下保存，连续 7 个月对试剂盒的外观、阴阳性符合率、检出限、线性、准确度、精密度进行考察，各项性能指标均符合要求，确定产品在规定的储存条件 下，可稳定保存 6 个月。 

此外，热景生物对产品的开瓶及冻融次数限度稳定性、运输稳定性和样本稳定性分别进行了研究。结果显示，产品的性能均满足产品说明书声称的要求。