蛋白质被认为是构成生物体细胞组织的重要成分。食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源，具有糖类和脂肪不可替代的作用。含氮量是蛋白质区别于其他有机化合物的重要标志。

 

牛乳中的蛋白质含量为3%～3.7%，是主要的含氮物质，其中主要为酪蛋白和乳清蛋白，还有少量的脂肪球膜蛋白。乳蛋白就整体而言，富含必需氨基酸且配比适宜，比自然界中任何其他天然食物都多，但酪蛋白中蛋氨酸的含量却较少。

 

乳中所含氮的95%为真蛋白，其余5%是非蛋白质含氮化合物，其中有尿素、氨、氨基酸和肌酸等。

 

在检验食品中蛋白质时，通常是先检定出食品中的总氮量，然后乘以蛋白质换算系数，以此得到蛋白质含量。凯氏定氮法由Kieldahl于1883年首先提出，至今仍被作为标准检验方法。凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定过程。

 

凯氏定氮法的原理及步骤

 

蛋白质是含氮的有机化合物。样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨，与硫酸结合生成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数（乳及乳制品换算系数为6.38），即为蛋白质的含量。

 

（1）消化　

 

浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。浓硫酸又具有氧化性，可将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原为二氧化硫。二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。蛋白+13H2SO4→(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 

 

消化时加入的硫酸铜是作催化剂，以加速分解反应，还可以加入氧化汞、氧化铜等作催化剂，为防止汞的污染，通常用硫酸铜较多。如果以汞或汞化合物作催化剂，则消化和加碱后，形成汞氨化合物。此化合物在蒸馏时不能完全分解，在这种情况下，必须加入锌粉或硫代硫酸钠或硫化钠，使汞氨化合物分解。

 

C+2CuSO4→Cu2SO4+SO2↑+CO2↑

 

Cu2SO4+2H2SO4→2CuSO4+2H2O+SO2

 

有机物消化完后，溶液具有清澈的硫酸铜的蓝绿色，同时硫酸铜在下一步蒸馏时可作碱性反应的指示剂。

 

在消化过程中添加硫酸钾，与硫酸反应生成硫酸氢钾，是为了提高溶液沸点，从而提高反应温度，加速反应过程。此外，也可以加硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点。

 

在消化过程中，随着硫酸的不断分解、水分的不断蒸发，硫酸钾的浓度逐渐增大，沸点升高，加速了对有机物的分解作用。

 

加入过氧化氢，是利用其氧化性，以加快反应速度：

 

2H2O2→O2+2H2O

 

（2）蒸馏　

 

在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，硫酸铵在碱性条件下释放出氨，通过加热蒸馏，氨随水蒸气蒸出：

 

(NH4)2SO4+2NaOH →2NH3+Na2SO4+2H2O

 

（3）吸收　

 

加热蒸馏时放出的氨可用硼酸溶液进行吸收。温度过高会使硼酸吸收液对氨的吸收作用减弱，从而造成损失，故一般不超过40 ℃。

 

2NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7+5H2O

 

（4）滴定　待吸收完全后，用硫酸或盐酸标准溶液滴定生成的硼酸铵，属于盐类的滴定。硼酸为极弱的酸，在滴定中并不影响所用指示剂的变色反应。

 

(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O→(NH4)2SO4+4H3BO3

 

(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO3

 

（5）计算根据硫酸或盐酸溶液消耗的体积，计算总氮含量，再乘以蛋白质系数（乳及乳制品换算系数为6.38），即为粗蛋白的含量。

 

注意事项

 

（1）加入样品及试剂时，避免黏附在瓶颈上。

 

（2）加入硫酸钾的作用：提高硫酸的沸点（338℃），增进反应速度。但过多的硫酸钾会造成沸点太高。生成的硫酸铵在513℃会分解，故此加入硫酸钾的量一定要准确。

 

（3）加入硫酸铜的作用：催化剂，使氧化作用加速。

 

（4）消化时，采用长颈圆底凯氏烧瓶斜支于电炉上，其操作必须在通风橱中进行，并使全部样品浸泡在消化液中，防止样品黏附在瓶颈上部，以致消化不完全；在消化过程中，样品炭化变黑，产生泡沫，这时要减小火力。勿使黑色物质上升到凯氏烧瓶颈部，待消化液均匀沸腾后，再加大火力，直至消化液黑褐色消失呈淡蓝色透明为止。如样品含脂肪较多时，应适当增加硫酸量，用硫酸量少时，过多的硫酸钾会形成硫酸氢钾而不与氨作用，导致氨损失。

 

（5）当样品消化液浑浊或未澄清透明时，可先将凯氏烧瓶放冷至室温后，再加入30%的过氧化氢，然后继续加热消化；

 

（6）蒸馏装置要安装平稳、牢固、严密，各连接部分不能漏气。水蒸气发生器装水不可太满，加玻璃珠以防爆沸。

 

（7）蒸馏时，蒸汽要发生均匀、充足，不得停火断汽，否则蒸馏瓶内压力降低会发生倒吸；避免瓶中的液体发泡冲出进入接收瓶。加碱量要足，动作要快，防止氨损失。冷凝管出口一定要浸入吸收液中，防止氨挥发损失。要保证蒸馏装置不能漏气。

 

（8）蒸馏结束后，应先将吸收液离开冷凝管口，以免发生倒吸。判断是否蒸馏完全，可用pH试纸测试冷凝管口的冷凝液而确定。

 

（9）在蒸馏时反应室与外界存在的压力差，蒸汽可将氨带出。故蒸馏时，要保证蒸汽均匀、充足，中间不能停止加热，防止发生倒吸；

 

常见问题解答

 

一、消化过程中容易沾壁怎么办？消化后定氮瓶内有黑色残留物怎么办？

 

解答：称样时需要注意切勿使样品粘附在定氮瓶颈部，避免因样品未消化完全而造成结果偏低。消化过程中如果发生沾壁在定氮瓶肚上或者定氮瓶肚上有黑色残留物，可以在消化较完全时摇动定氮瓶，把定氮瓶肚上的黑色物质摇洗下来。摇动的方法是取下小漏斗，戴上防烫手套，手掌紧握瓶颈，向前后侧甩，使瓶内液体呈半旋转半振荡状态，注意控制力度不要让液体溅离瓶口。

 

二、硫酸钾的作用是催化剂吗？

 

解答：硫酸钾的作用是提高溶液沸点，从而加快有机物分解。但是不能加入过多的硫酸钾，否则会因为温度过高，使生成的硫酸铵发生热分解成氨而造成损失。

 

三、硫酸铜是否是消化终点以及加碱蒸馏时的指示剂？

 

解答：硫酸铜的作用有三个，分别为：

 

①催化作用：加速有机物的氧化分解。

 

②消化完全的指示剂：使液体呈现蓝绿色澄清透明状态。

 

③蒸馏时碱性反应的指示剂：产生褐色沉淀。

 

四、混合指示剂必须临用时混合吗？

 

解答：混合指示剂必须临用时混合。

 

五、蒸馏的时取下锥形瓶需要用洗瓶冲洗吗？不冲洗会有误差吗？

 

解答：需要冲洗冷凝管下端以防止产生结果误差。蒸馏后移动蒸馏液接收瓶,液面离开冷凝管下端,再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部,然后取下蒸馏液接收瓶。

 

六、蒸馏仪器的检漏如何操作？

 

解答：可以将蒸馏装置连接好后，在接口以及瓶塞等可能漏气的地方滴加少量水，打开电炉加热，观察有无气泡产生。

 

七、硼酸可以多加吗？

 

解答：不可以。按国标的要求正确操作，10mL硼酸足够。

 

八、滴定时消耗了很多盐酸溶液，能否换浓度高的盐酸溶液滴定？

 

解答：不能更改国标给出的滴定液浓度。蛋白质含量较高的样品可以适当减少称样量，或合理范围内减少吸取消化液的体积V3。

 

九、空白消耗标准滴定液的体积指的是什么？

 

解答：试剂空白实验消耗的标准滴定溶液的体积就是空白体积。

 

十、同时有两种蛋白怎么换算？

 

解答：同时含有多种蛋白质，且折算系数不相同时可以按复合配方食品换算蛋白质系数。

 

凯氏定氮仪使用的常见问题解答

 

1.凯氏定氮仪在蒸馏时翻滚剧烈，会对操作者构成危险吗？

 

答：一般不会，凯氏定氮仪在蒸馏时翻滚剧烈，是水蒸气大量进入消化管液体翻滚，并非剧烈反应造成；而且仪器有超压保护装置，可以保持管路内部常压，避免危险。

 

2.凯氏定氮仪工作中对水质有什么要求？

 

答：凯氏定氮仪的蒸馏水桶内要装蒸馏水或纯水，机器长期不用要将蒸馏器里水放掉。

 

3.凯氏定氮仪开机没声音是怎么回事？

 

答：凯氏定氮仪开机没声音，如果机器电源开关内红灯亮，说明是定氮仪内保险管烧断了，保险管位置在机器内部靠近电源开关接口5公分处黑色壳子内。

 

4.凯氏定氮仪开机后蒸馏器内不加水怎么解决？

 

答：开机半分钟后检查蒸馏水桶是否漏气，能被气充鼓是正常；检查蒸馏水桶内水位是否超过三分之一，不够补齐；检查蒸馏水桶的位置，低于放置仪器的台面，压力不够，加不上水；检查蒸馏水桶进气、进液管是否接错，接错桶内会产生气泡并发出声响；检查排水阀，应呈关闭状态。

 

5.凯氏定氮仪蒸锅不加热，不能产生蒸气，为什么？

 

答：如果机器能正常加碱，不能加热出蒸气，判定加热丝可能烧坏了，可拿万用表量一下加热丝正负极，不通可确定加热丝损坏，换新加热丝。

 

如果机器不能正常加碱，开机后又没有任何声音，判断是保险丝烧断了，保险管位置在机器内部靠近电源开关接口5公分处黑色壳子内。

 

6.凯氏定氮仪工作时声音大，是否正常？

 

答：属于正常现象，这是机器内部气泵工作的声音。

 

7.凯氏定氮仪工作中不能加碱、加碱没有声音，为什么？

 

答：检查碱桶是否漏气，被气充鼓机器才能正常工作；仪器使用时间过长，碱管内部会产生结晶，导致加液时流速降低，没有声音。

 

8.定氮仪在工作时，从顶部冒出类似烟的气体，怎么回事？

 

答：检查冷却水进水的水龙头是否打开，冷却水关闭或者水量小都会导致消化管出来的蒸气不能被冷凝，从机器里冒出来的水蒸气，看起来类似烟。

 

9.定氮仪使用中发现消化管进满水，怎么解决？

 

答：定氮仪使用中发生消化管进满水，是由于机器控制水位器导电性降低造成的，解决办法：打开水位器取出探针用砂纸打磨，去掉氧化层；在蒸馏水桶里加入3-5克实验室用氯化钠，摇匀溶解。

 

10.定氮仪使用中发生蒸馏器、水位器进满水，硼酸吸收液容器中进水，怎么解决？

 

答：是机器控制水位器导电性降低造成的，解决办法：打开水位器取出探针用砂纸打磨，去掉氧化层；在蒸馏水桶里加入3-5克实验室用氯化钠，摇匀溶解。

 

11.定氮仪使用中消化管中白色管子发生倒吸，怎样解决？

 

答: 仪器停止工作（蒸馏器停止加热），气阀未能及时关闭，会产生倒吸现象，可在白色管子上扎一些小孔。气阀损坏，不能关闭，也会倒吸。

 

12.定氮仪工作中隔3-5秒钟会发出声响，是否正常？

 

答：这种声响属于正常现象，仪器工作状态下，蒸馏器会不断加热产生水蒸汽而消耗水，仪器会自动打开水阀进行补水，声响就是水阀打开、关闭的声音，属于正常现象。

 

注：

 

①每次使用仪器前，应让仪器空煮一次，清洗仪器的内部管路。

 

②仪器使用完毕，应将其中一只桶的桶盖打开，将桶内的气体排出，延长附件的使用寿命（3个或2个桶串联，排气时只打开一只桶盖即可）。