一、无菌操作技术

1、定义　

是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法；

无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是保证微生物实验准确和顺利完成的重要环节。

2、内容

无菌操作技术主要包括两方面：

1）创造无菌的培养环境。包括提供密闭的培养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌等；

2）在操作和培养过程中防止一切其它微生物的侵入的措施。包括紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器皿灭菌、操作方法等。

3、无菌操作原则

1）在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区，接种时必须穿工作服、戴工作帽，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球将手擦干净；

2）在操作前20～30分钟要先启动超净台和紫外灯，进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼3次后使用。严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的钳、镊子等；

3）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不能触及试管或平皿边；

4）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒；

5）接种环或接种针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必须时还要烧到环和针与杆的连接处；

6）吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。倾倒平板应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。

 

二、无菌操作的环境要求

1、无菌室

（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间；

（2）无菌室的消毒和防污染

•每日（使用前）紫外线照射（0.5~1小时）； 

•每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒；

•每季度用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时），特殊情况下可增加熏蒸频次。

（3）无菌室使用要求

①无菌室内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，拭擦工作台面，不得存放与实验无关的物品；

②无菌室使用前后应将门关紧，打开紫外线，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻拭擦，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响；

③处理和接种食品标本时，进入无菌室操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。在无菌室内如需要安装空调时，则应有过滤装置。

2、超净工作台

超净台的使用与保养：

（1）风速稳定，且符合要求；

（2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上；

（3）让超净台预工作10－15分钟；

（4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净。

3、无菌器材

（1）灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等；

（2）消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台、手等。

（3）无菌间一般只允许放置无菌操作台、转椅等物品；无菌操作台上一般只允许摆放以下物品： 酒精灯、打火机、接种针、消毒棉球、洗耳球、镊子、油性笔、灭菌平皿、试管架、灭菌吸管、电子天平、250ml灭菌三角瓶、培养基、均质器等。

 

三、无菌操作的基本技术

1、无菌接种操作

培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。

在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。

 

 

2、微生物检验过程中的无菌操作要求

（1）在操作中不应有大幅度或快速的动作；

（2）使用玻璃器皿应轻取轻放；

（3）在正火焰上方操作；

（4）接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；

（5）在接种培养物时，协作应轻、准；

（6）不能用嘴直接吸吹吸管；

（7）带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。

3、无菌操作技术详细图解

（1）取菌技巧

 

 

 

 

 

 

 

 

（2）接种技巧

 

 

 

（3）错误示范

 

 

 

 

 

 

微生物的接种、分离纯化和培养技术

 

一、接种

1、接种定义

接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。

2、接种工具

在实验室中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。

1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀

3、微生物检验常见接种方法

（1）划线接种法

 

 

平板划线分离法--分区划线分离法

①用接种环先将培养物涂布于平板1区并作数次划线，再在2、3……区依次划线；

②每划完一个区域，转动培养皿约70度角，并将接种环灭菌一次，待冷后再划下一区域；

③每一区域的划线均接触上一区域的接种线1～2次，使接种量逐渐减少，以获得单个菌落；

④其他操作与上述曲线划线分离法相同。

（2）斜面接种法

主要用于经划线分离培养所获得的单个菌落的移种，以及观察细菌的某些培养特征。

以菌种移种为例，其接种方法是：

①  取一菌种管和培养基管，置左手食指、中指、无名指间，拇指压住两管底部上侧面，使菌种管位于外侧，培养基管位于内侧；

②  右手拇指和食指分别旋松两管棉塞。火焰灭菌接种环；

③  以右手小指与手掌，小指与无名指分别夹取棉塞（先外管后内管），将两管口迅速通过火焰1~2次；

 

 

④将已灭菌的接种环伸入菌种管中，从斜面上取菌少许，迅速伸入待接种的培养基管中，在斜面底部向上划一条直线，然后从底部起向上作曲折连续划线，直至斜面上方顶端；

⑤取出接种环，火焰灭菌管口，塞上棉塞（先塞内管）；最后将接种环经火焰灭菌放好；

⑥做好标识，置35℃培养箱中培养18~24小时。斜面培养一般形成均匀一致的菌苔。一般可观察表面、透明度、色泽等特征。

 

（3）涂布接种法 

涂布法接种是一种常用的接种方法，不仅可以用于计算活菌数，还可以利用其在平板表面生长形成菌苔的特点用于检测化学因素对微生物的抑杀效应。

原理：将一定浓度，一定量的待分离菌液移到已凝固的培养基平板上，再用涂布棒快速地将其均匀涂布，使长出单菌落而达到分离的目的。

 

 

（4）液体接种法（肉汤接种）

①如斜面接种法持好菌种管及培养基管；

②灭菌接种环，从菌种管取菌，伸入培养基管中，在接近液面的管壁上方轻轻研磨，并沾取少许培养基液体调和，使细菌混合于培养基的液体中。液体培养基一般以18~24小时培养后观察生长特征。

肉汤培养可观察如下几项：

a.发育程度：有无生长、微弱、中等、旺盛；

b.混浊度：有无及程度（混、中等、微混、透明）、均匀混浊、有颗粒、絮状生长；

c.沉淀：有无及量多少、性状（粉状、颗粒状、絮状、沾性）；

d.表面：有无生长、性状（膜状、环状）、菌膜厚薄及表面特征（光滑、颗粒、皱状）；

e.其他：有无特殊气味，色素。如果是糖发酵培养基则主要观察是否产酸和有无气体。

（5）穿刺接种法（半固体接种）

多用于保存菌种、观察动力及厌氧培养等也可以用于观察细菌的某些生化反应。

①如斜面接种法持好菌种管及培养基管；

②以灭菌接种针从菌种管取菌，垂直刺入培养基的中心（半固体或一般琼脂高层）直达近管底部（但不能完全刺到管底），接种针应沿原路退出；

③经培养后半固体培养基可观察到：沿穿刺线生长，线外的培养基清亮表示细菌无动力；穿刺线模糊不清，或沿穿刺线向外扩散生长，或整个培养基混浊表示细菌有动力。

二、分离纯化

1、几个定义 

混和培养物：含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixed culture）；

纯培养：如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pure culture）；

分离纯化：在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物，得到纯培养的过程称为分离纯化。包括倾注平板法、涂布平板法、平板划线法等等。 

2、倾注平板法（倒平板）

将无菌培养皿放入生物安全柜或净化台中，然后分别倒入15ml已融化并且冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，待凝固之后，把这平板倒置在恒温培养箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。整个操作过程应严格按照无菌操作。

三、微生物的培养方法

微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到许多外界因素的影响，如营养物浓度、温度、水分、氧气、pＨ等。微生物的种类不同，培养的方式和条件也不尽相同。通常分为： 

1、一般培养法（需氧培养）    

培养温度：25~37℃ 。

2、厌氧培养方法

（1） 简易的厌氧培养法：

A、 庖肉培养法

B、铁丝圈厌氧培养法

C、焦性没食子酸法

（2） 厌氧罐法

（3） 厌氧手套箱法

厌氧缸法：

厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。

接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养。

厌氧罐法：

装入待培养的对象，然后密闭罐盖，接着可采用抽真空→灌氮→抽真空→灌氮→抽真空→灌混合气（N2∶CO2∶H2=80∶10∶10，V/V）。

 

 

 

3、二氧化碳培养法

（1）烛缸法

（2）二氧化碳置换法

（3）化学法

每一升用重碳酸钠0.4克与浓盐酸0.35亳升加入。

（4）二氧化碳培养箱法

 

 

 

四、微生物常规鉴定技术

1、形态结构和培养特性观察

（1）在固体培养基上，观察：

菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等；

（2）在液体培养中：

表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等；

（3）半固体培养基穿刺接种：

观察运动、扩散情况。

 

 

2、染色镜检

（1）染色原理

由于微生物细胞含有大量水分，机体是无色透明的，与周围背景没有明显的反差， 必须进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。 

微生物中细菌、致病菌是很小的生物体，必须通过染色的方法，在显微镜下才能看得清楚，并且还可以通过染色的方法鉴别革兰氏染色特性，以及是否长有鞭毛、周毛、荚膜和芽孢等。

（2）染色方法

①简单染色法

简单染色法又叫作普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色，观察细菌的形态。

②复染色法

用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。

（3）革兰氏染色法

①原理

革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。1884年由丹麦医师Gram创立。
染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；

染色反应呈红色的称为革兰氏阴性细菌，用G―表示。

细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。

②细菌的革兰氏染色步骤

涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脱色→水洗→复染→水洗→干燥→观察

A）取培养物分别做涂片、干燥、固定，方法均与简单染色的相同；

B）用草酸铵结晶紫染色1min后水洗；

C）加碘液媒染1min后水洗；

D）斜置载玻片，滴加95％乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20～30s，随即水洗；

E）用蕃红染液复染30s，水洗；

F）用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。