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嘉峪检测网 2019-12-18 17:55
摘要
2020版0512高效液相色谱法新增内容较多，本文对其进行汇总整理，并与USP、EP相关收录内容进行对比，以期了解其内涵，在日常工作中更好的运用，解决实际问题。不足与错误之处望同行批评指正。
一、对仪器的一般要求和色谱条件—新增电喷雾检测器
1.1测定原理：基于雾化检测器的原理，洗脱液经雾化后形成颗粒，经过蒸发管干燥后与带电氮气碰撞，使得分析物颗粒表面带上正电荷，最后通过静电计测量分析物颗粒表面的电荷量。CAD的定量基础为峰面积与分析物颗粒表面所带电荷量相关，分析物颗粒表面电荷量与分析物质量相关。
1.2 检测器示意图：示意图如下，柱子的洗脱液被雾化，流动相也被蒸发，类似于ELSD或MS检测器，气化的分析物与氮气流混合（氮气流已被电晕针放电装置带上了正电荷），电荷随之转移到分析物颗粒上，为了提高信号的质量，流动相中较大的物质在离子阱中被除去。剩余的带电分析物离子被静电检测器检测到。
CAD对挥发性比流动相小的化合物都有足够的灵敏度，流动相中不能含有不挥发性的盐类。
1.3适用范围：适用于紫外吸收较弱或无紫外吸收杂质的检测，可作为RI或ELSD代替的检测器测定糖类或其它碳水化合物。（本节摘自药事纵横分析方法开发-检测器的选择）
二、对仪器的一般要求和色谱条件—新增分析方法允许的调整范围
2.1、调整范围
分析方法在其使用周期里极有可能发生变更或调整。例如，如果方法不再满足性能要求，就可能要求改变方法参数以达到最初制定的性能指标。那么何时要对方法进行重新验证以及如何将其形成文件。
验证过的分析方法常常不能达到预期的效果。比如，液相色谱峰达不到方法规定的分离度。可能的原因有：
1. 方法由研发实验室转移到常规实验室，或在常规实验室间进行转移。
2. 把法定方法或标准方法引入实验室。
3. 使用了相同或不同厂家不同型号的仪器，其性能参数不同，比如不同 HPLC 的延迟体积不同。
4. 使用时间久了，色谱柱性能发生改变。
5. 新批号的色谱柱性能不同。
6. 引进新技术优化分析，例如，节约运行成本，减小色谱柱内径以节约流动相，或减小粒径以节约分析时间。
通常分析人员会尝试改变一些方法参数，如流动相组成、柱温或流速，以使方法性能达到原来的技术指标。但分析人员对这类改变以后是否需要重新验证方法不甚清楚。
在欧洲药典EP9.0、美国药典USP40-NF35的色谱法通则及2020版《中国药典》通则0512征求意见中可以找到这个问题的答案。这些通则中列出了液相色谱和气相色谱中的一些性能参数，只要符合系统适用性的要求，这些参数即使改变也无需重新验证，各国药典相关要求如下表所示：
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高效液相色谱法 |
USP |
EP |
Chp2020 |
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固定相 |
/ |
/ |
不得改变固定相的理化性质，如填料材质，表面修饰及 键合相均需保持一致；从全多孔填料到表面多孔填料的 改变，在满足上述条件的前提下是被允许的 |
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色谱柱长度 |
±70% |
±70% |
改变色谱柱粒径和柱长后，L/dp 值(或 N 值)应在原有数值 的-25%～+50%范围内 |
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内径 |
可调整，但线速度不变 |
±25% |
/ |
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粒径 |
可以减小50%，不能增加 |
可以减小50%，不能增加 |
同柱长要求 |
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流速 |
±50%，线速度不变，调整幅度可以更高 |
±50% |
F2=F1×[(dc2 2×dp1)/(dc1 2×dp2)]，在此基础上可以根据实际 使用时系统压力和保留时间，允许流速在±50%的范围内 进行调整 |
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柱温 |
±10 ℃ |
±10% |
当温度有规定时，可在±10℃范围内调整 |
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进样量 |
可以减小（LOD和重复性没问题） |
可以减小（LOD和重复性没问题） |
Vinj2=Vinj1×(L2×dc2 2)/(L1×dc1 2)，并根据灵敏度的需求进行 调整。即便没有对色谱柱尺寸进行调整，进样体积也可调整以满 足系统适用性的要求 |
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pH |
±0.2 |
±0.2（中性物质±1） |
除另有规定外，流动相中水相 pH 值可在±0.2pH 范围内进 行调整 |
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UV波长 |
不允许调整 |
不允许调整 |
不允许改变 |
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缓冲液中盐浓度 |
±10% |
±10% |
可在±10%范围内调整 |
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流动相组成 |
少量组分（<50%）相对变化量±30%或绝对变化量为±10%，取二者较小者 |
少量组分相对变化量±30%或绝对变化量为±2%，取二者较小者 |
等度洗脱流动相比例：最小比例的流动相组分可在相对值±30%或者绝对值±2% 的范围内进行调整（两者之间选择最大值）；最小比例流动 相组分的比例需小于（100/n）%，n 为流动相中组分的个 数 梯度洗脱程序：tG2=tG1×(F1/F2)×[(L2×dc2 2)/(L1×dc1 2)]，保持不同规格色谱 柱的洗脱体积倍数相同，从而保证梯度变化相同，并需要 考虑不同仪器系统体积的差异 |
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气相色谱法 |
USP |
EP |
Chp2020 |
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色谱柱长度 |
±70% |
±70% |
不涉及 |
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色谱柱内径 |
±50% |
±50% |
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粒径 |
允许变化必须通过系统适用性实验 |
-50%，不得增大 |
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液膜厚度 |
-50~100% |
-50~100% |
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流速 |
±50% |
±50% |
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柱温 |
±10 % |
±10 % |
|
|
进样量 |
可以减小（如果LOD和重复性没问题） |
可以减小（如果LOD和重复性没问题） |
Chp相关备注：F1：原方法中的流速 F2：调整后方法中的流速 dc1：原方法中色谱柱的内径dc2：调整后方法中色谱柱的内径 dp1：原方法中色谱柱的粒径 dp2：调整后方法中色谱柱的粒径；Vinj1：原方法中进样体积；Vinj2：调整后方法中进样体积；L1：原方法中色谱柱柱长 L2：调整后方法中色谱柱柱长 tG1：原方法的梯度段洗脱时间 tG2：调整后的梯度段洗脱时间，可通过相关软件计算表 1 中流速、进样体积和梯度洗脱程序的调整范围，并根据色谱峰分离情况进行微调。若调整超出上表中规定的范围，调整的方法应进行相应的方法学验证。
以上给定的限度范围不得理解为任何方法都可以在所有性能参数的限度范围内任意改变。USP和EP要求在任何变更之后进行系统适用性试验。如果能够达到系统适用性的标准，则不要求进行重新验证。换句话说，应对方法的性能进行证实，但不需要重新验证。基点应该是前一次重新验证的参数，而不是方法发生变更的前一次参数。例如， 如果最初验证的流速是1.0ml/min，第一次变为1.4（40%），接着又 变成1.7（从前一次变化算是20%，而按基点计算应是70%），这时， 即使能够通过系统适用性试验，也要重新进行方法验证。下图给出了色谱法需要变更时可以遵循的流程图。
2.2、方法调整与方法验证中耐用性的关系
液相色谱法中的典型影响耐用性的变动因素
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可变参数 |
允许变化范围 |
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分离检测系统典型变量 |
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流动相的pH值（HPLC） |
用于流动相制备的缓冲溶液的pH能够在±0.2或指定的范围内调整。 |
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流动相的组成 |
用于流动相中有机相的比例调整，通常情况是在±5%的范围内进行调整。 |
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缓冲液中盐的浓度（HPLC） |
用于制备流动相的缓冲溶液的盐的浓度能在±10%的范围内调整，且允许的变动符合上述要求。 |
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紫外检测器波长（HPLC） |
方法中偏离指定波长是不被允许的，检测器供应商指定的程序或其他程序可以被用于确认检测器波长的误差最大不能超过±3 nm。 |
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柱温（HPLC） |
能被在±10%范围内调整。为了提高保留时间的可控性和重现性推荐使用柱温箱。 |
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其它项 |
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供试品的稳定性、样品的提取效率、滤膜吸附、方法的重现性等 |
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由上述内容可知，方法验证中的耐用性与方法可调整范围的异同点如下：
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不同点 |
方法的耐用性 |
方法的可调整范围 |
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目的 |
评估方法的耐受性 |
当方法无法满足测定要求时，确定允许方法调整的范围 |
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适用范围 |
所用涉及验证的方法，均需进行该项 |
方法转移过程、更换不同型号检测仪器、引进新检测技术等 |
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相同点 |
方法的耐用性 |
方法的可调整范围 |
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评价指标 |
采用系统适用性实验及样品的测定结果进行评估 |
同耐用性评价指标 |
2.3、重新验证
下列情况要求重新进行方法验证：
1) 为达到最初的性能要求而变更方法，且该变更超出了相关指导原则的容许范围
2) 分析的新化合物不在方法的原定范围内
3) 样品基质发生改变
发生任何这类变更时，均应按变更控制程序要求将其形成文件，并对方法进行重新验证。变更控制程序应要求明确变更原因。变更应得到授权并制成文件后方可实施。应证明性能测试的合理性并制成文件，并且变更应予以正式发布。
三、系统适用性实验（与USP、EP对比列表统计异同）
色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、灵敏度、拖尾因子和重复性等五个参数。按各品种正文项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当调整，以符合要求。
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参数 |
2020版《中国药典》 |
USP |
EP |
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理论踏板数（n） |
按 n = 16(tR/W)2或 n = 5.54(tR/Wh/2)2计算色谱柱的理论板数。tR、W、Wh/2可用时间或长度计（下同），但应取相同单位。 |
计算公式同《中国药典》 峰谷比（p/v）峰谷比用于当分离两峰的基线无法达到时，作为在有关物质的测定时的系统适用性参数，如下图3所示，当使用了电子积分仪时，可能以n = 5.54(tR/Wh/2)2方便的测定理论踏板数，当有争议时，将只使用基于基线处的峰宽度的方程式。 |
仅收录了半峰宽的计算公式， n = 5.54(tR/Wh/2)2 峰谷比同USP |
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分离度（R） |
除另有规定外，待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应大于 1.5。分离度的计算公式为： R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)或R=2(tR2-tR1)/1.70( W1,h/2+ W2,h/2) 式中 tR2为相邻两色谱峰中后一峰的保留时间； tR1为相邻两色谱峰中前一峰的保留时间； W1、W2及W1,h/2、W2,h/2分别为此相邻两色谱峰的峰宽及半高峰宽，如下图4所示。 当对测定结果有异议时，色谱柱的理论板数（n）和分离度（R）均以峰宽（W）的计算结果为准。 |
当使用电子积分仪时，R=1.18(tR2-tR1)/ ( W1,h/2+ W2,h/2)，其它同《中国药典》
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对于基线分离，分离度应大于1.5，R=1.18(tR2-tR1)/ ( W1,h/2+ W2,h/2) 如果不是基线分离，上述公式不适用 |
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灵敏度 |
定量测定时，信噪比应不小于 10；定性测定时，信噪比应不小于 3 |
信噪比S/N=2H/h 定量测定时，信噪比应不小于 10；定性测定时，信噪比应不小于 3 定量限需满足准确度和精密度的相关要求。见下图5 |
同USP相关要求 |
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拖尾因子（T） |
T=W0.05h/2d1 W0.05h为 5％峰高处的峰宽；d1为峰顶在 5%峰高处横坐标平行线的投影点至峰前沿与此平行线交点的距离（见下图6） 以峰高作定量参数时，除另有规定外，T 值应在 0.95～1.05 之间 以峰面积作定量参数时，一般的峰拖尾或前伸不会影响峰面积积分，但严重拖尾会影响基线和色谱峰起止的判断和峰面积积分的准确性，此时应在品种正文项下对拖尾因子作出规定。 |
计算公式同《中国药典》
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计算公式同《中国药典》 通常对称因子要求0.8-1.5 |
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重复性 |
除另有规定，外标法，连续5针RSD应不大于2.0%；内标法，配制80%、100%、120%三种不同浓度溶液，分别至少进样2次，平均校正因子的RSD不得过2.0%，当待测成分是微量或痕量，进样量少或其色谱峰响应值较小时，对相对标准偏差的要求可适当放宽。 |
RSD%=KB√n/t90%，n-1，RSD为相对标准偏差，K为常数0.349，B为各论中给出的上限减去100%（引申为含量的范围要求），n为参考溶液重复进样的次数（3 ≤n ≤6），t90%是在n-1自由度90%的概率下的一组t值（双侧） （见下图7） |
同USP |
图3
图4
图5
图6
图7
结论：各国药典对系统适用性的要求不尽相同，但涉及的计算公式基本一致，研究中应根据具体品种的特性，制定适合自己的系统适用性要求，确保检测数据的准确，可重现。
解析：该段描述中“保留时间应无统计学意义上的显著性差异”该如何判断，统计学意义首先应具备一定的样本量，若采用T-test，以P值判定是否有差异性，仅考虑的数学统计意义上的差异性，而方法本身的偏离无法考虑在内，容易做出误判。USP23版<621>曾规定保留时间的比值在0.98-1.02之间为符合规定，如不符合，混合相同体积的分析溶液和标准溶液，注入色谱中，混合溶液谱图不得有肩峰，峰面积与混合体积成比例。该方式对于保留时间短的化合物控制过于严格，对于保留时间长的化合物控制又过于宽松。个人认为可采用保留时间T均值±3sigma方法确定保留时间的区间，但该方式需要具有一定的样本量作为基础，举例如下：
|
次数 |
保留时间 |
|
1-1 |
3.154 |
|
1-2 |
3.152 |
|
1-3 |
3.034 |
|
1-4 |
3.215 |
|
1-5 |
3.065 |
|
均值 |
3.124 |
|
SD |
0.073 |
|
3SD |
0.220 |
|
区间 |
3.124±0.22 |
若超出该范围，建议采用相对保留时间对比结合光谱相似度或质谱的方式进行。
（2）利用光谱相似度定性
化合物的全波长扫描紫外光谱图提供一些有价值的定性信息。待测成分的光谱与对照品的光谱的相似度可用于辅助定性分析。用二极管阵列检测器可得到更多的信息，包括色谱信号、时间、波长的三维色谱光谱图，其定性结果以及用于峰纯度分析，与紫外检测器相比具有更大的优势。同样应注意，两个光谱不同的色谱峰表征了不同化合物，但两个光谱相似的色谱峰未必可归属为同一化合物。
（3）利用质谱检测器定性
利用质谱检测器提供的色谱峰分子质量和结构的信息进行定性分析，可获得比仅利用保留时间或增加光谱相似性进行定性分析更多的、更可靠信息，不仅可用于已知物的定性分析，还可提供未知化合物的结构信息。
五、多维液相色谱（新增）
多维色谱又称为色谱/色谱联用技术，是采用匹配的接口将不同分离性能或特点的色谱连接起来，第一级色谱中未分离开或需要分离富集的组分由接口转移到第二级色谱中，第二级色谱仍需进一步分离或分离富集的组分，也可以继续通过接口转移到第三级色谱中。理论上，可以通过接口将任意级色谱串联或并联起来，直至将混合物样品中所有的难分离、需富集的组分都分离或富集之。但实际上，一般只要选用两个合适的色谱联用就可以满足对绝大多数难分离混合物样品的分离或富集要求。因此，一般的色谱/色谱联用都是二级，即二维色谱。
在二维色谱的术语中，1D和2D分别指一维和二维；而1D和2D则分别代表第一维和第二维。
二维液相色谱可以分为差异显著的两种主要类型。若两种色谱的联用仅是通过接口将前一级色谱中某一（些）组分传递到后一级色谱中继续分离，这是中心切割式二维色谱（heart-cutting mode two-dimensional chromatography），一般用LC-LC（也有用LC+LC）表示。但当两种色谱联用，接口将前一级色谱中的全部组分连续地传递到后一级色谱中进行分离，这种二维色谱称为全二维色谱（comprehensive two-dimensional chromatography），一般用LC×LC表示。LC×LC是将1D色谱柱的流出物连续转移至2D色谱柱。相比之下，LC-LC则是将1D流出物选择性地（部分地）转移至2D色谱柱。此外，这两种类型下还有若干子类，包括选择性二维色谱（sLC×LC）和多中心切割2D-LC（mLC-LC）。
LC-LC 或 LC×LC 两种二维色谱可以是相同的分离模式和类型，也可以是不同的分离模式和类型。接口技术是实现二维色谱分离的关键之一，原则上，只要有匹配的接口，任何模式和类型的色谱都可以联用。和一维色谱一样，二维色谱也可以和质谱、红外和核磁共振等联用。
目前该项技术在蛋白质组学、中药活性物质研究中占有十分重要的地位，随着化药杂质研究的深入，该项技术必将有广泛的应用。
参考文献
[1] 2020版0512高效液相色谱法征求意见稿
[2] 分析方法验证基础导论
[3] 有关液相色谱和气相色谱中保留时间的一致性
[4] 欧洲药典EP9.0
[5] 美国药典USP40-NF35
来源：雷阵雨药事纵横
