为确保对色谱峰进行正确的测量（或积分），需要分析人员对积分结果进行准确性和一致性判断。在大多数情况下，人为参与的过程往往会导致判断结果受到非客观标准的影响。所以色谱积分的合理合规性尤为重要，这也是监管机构的审查重点，这篇文章我们将简要讨论如何对色谱积分进行合理合规性控制。

1       简介

高效液相色谱（HPLC）和气相色谱（GC）是现代分析实验室中最常用的技术。这两种技术的专属性、灵敏度和灵活性使其适用于广泛的样品基质中绝大多数被分析物的测定。这两种技术的原始输出都是信号强度对比时间的曲线图，通常称为色谱图。色谱图中的各个峰分别对应于样品中的各个成分，而峰面积通常正比于样品中相应成分的浓度。

要定量样品中的被分析物浓度，就需要对色谱图进行积分以测量峰的面积。现代高效液相色谱法和气相色谱仪配备的电脑色谱数据采集和处理系统，都具备自动化积分的功能，分析人员需要做的主要是设定适当的积分参数（例如：斜率灵敏度，噪声阈值，峰宽阈值，峰面积的阈值，峰高阈值，撇去率等），软件将依据这些参数来对各个色谱峰进行确认和积分。

2       监管要求

由于分析人员可以根据自己的主观判断人为地设定积分参数，无论在常规审查或药品生产上市授权评估过程中，对色谱峰正确和精确的积分及其过程都是重点审核内容。

从美国FDA对药企发布的警告信中，可以看到关于色谱积分的一些更加具体化的要求：不允许采用手动积分。

需要开启色谱软件的审计跟踪功能，并将包含积分参数的分析方法和原始数据一同保存，以确保方法的积分参数修改历史可追溯。

“更改积分参数，以得到好的积分结果”是不可接受的。在审查过程中，没有合理解释的多次重新积分被认为是企图人为操纵峰面积以获得合格的结果。

方法一旦经过验证且被用于药品的常规QC放行，对后续每个色谱数据的积分都需要使用该方法以确保一致性。FDA当前的期望实际上是倾向于将色谱方法“锁定”以保证始终使用同样的积分参数。

综合来讲，色谱峰的积分、积分参数的设定和验证、积分参数的修改和再验证等都要遵循科学合理的过程，并通过标准操作规程（SOP）或类似的文件进行控制。

3       控制色谱积分的合理合规性

那么，要怎样控制色谱积分的合理合规性呢？我们分以下几个小节来探讨。

3.1       通用积分过程及参数

为了对积分参数进行设定，有必要了解色谱数据处理程序是如何进行积分的。这里将尝试讨论一个通用的过程，不同的色谱数据处理系统可能在细节上有所不同。

色谱积分过程包括下列事件：

a. 确定初始基线

首先取第一数据点作为一个暂定基线点。然后积分器取一定数据点的平均值重新定义初始基线点。用作取平均值的数据点数是由峰宽函数决定的。在确立了的新的基线点前，第一数据点被取作初始基线点。

b. 连续追踪和更新基线

随着积分器不断录入新的数据点，基线点需要向后推移并更新。被接纳为基准点，一个数据点必须符合以下条件：

它必须在所指定的由斜率阈值决定的基线阈值内；

基线的曲率必须低于由斜率阈值确定的阈值；

累积总和不能超过指定的面积阈值；

基线以由峰宽值决定的速率不断重置，直到检测出色谱峰；

c. 色谱峰开始时间的识别和确认

当新录入的数据点超出基线阈值，并且基线曲率超过由斜率灵敏度函数确定的设定值，即辨别出一个潜在的色谱峰。如果接下来的数据点保持上升，并满足下列条件，积分器即识别出一个潜在的色谱峰开始时间。

斜率和曲率超过由基线阈值确定的限值；

连续的数据点之间的差值超过噪声阈值；

潜在的色谱峰开始时间被确认的条件需要符合下列标准：

斜率继续超过由基线阈值确定的限制；

累计面积超出峰面积阈值；

曲率变为负值形成前拐点；

d. 色谱峰顶点的确认

峰顶点的确认需要满足下列条件：

斜率通过零点并变为负值；

曲率变为正值；

后续数据点的值降低，且该数据点与后续3个数据点的峰面积差累计超过2/3的峰面积阈值；

e. 色谱峰终点的识别和确认

色谱峰潜在终点的识别条件：

斜率和曲率回落到由基线阈值确定的限值内；

两个连续的数据点之间的差值小于0.5倍噪声阈值；

色谱峰终点的确认条件：

斜率和曲率保持在基线阈值确定的限值内；

在方法建立过程中，依据不同参数对色谱积分事件的作用进行各参数（斜率灵敏度，噪声阈值，峰宽阈值，峰面积的阈值，峰高阈值等）的设定。

3.2       未完全分离色谱峰

对于色谱峰的最准确的积分要求所有的峰完全分离。如有某些需要精确定量测定的峰没有完全分离，首先需要优化色谱分离条件。在经过大量努力后还是不能获得充分分离的情况下，可以考虑通过合理的积分获取未分离组分相对的准确峰面积。

如果定量数据必须从未分离峰获得，需要制定明确的规定，以便确定未分离峰应该如何积分。这样的规定应该包含在什么情况下可以使用什么功能对未分离色谱峰进行积分，这些功能包括：

切线撇去；

指数撇去；

指数曲线拟合；

直线撇去；

前伸峰撇去；

拖尾峰撇去；

峰谷比；

谷高比；

谷垂直切分；

3.3       积分效果的基本要求

进行合理合规的积分需要明确怎样才算是适当和准确的积分。笔者认为原则性的标准应该是“不多不少”地积分。

为使同一实验室内不同分析人员有一个统一的标准，建议在书面文档中用图表来说明什么是可接受的色谱峰，什么是不可接受的色谱峰。如图2，其中峰A表示可接受的积分峰；而峰B是不可接受的峰积分，因为峰的拖尾部分未被完全积入； 峰C也是不可接受的，因为将可能是基线漂移的区域积进去了。

3.4       积分参数的设定和验证

在做主成分测定时，数据处理方法的控制相对容易。但是当涉及到有关物质测定时，数据处理方法的开发和控制有时候是非常具有挑战性的。建议在方法学的准确度和精密度验证部分，专门考察改变积分参数对最终结果的影响。可以使用在回收率实验中获得的原始数据，对下面的主要积分参数进行系统化地测试（不同的数据处理软件可能有不同的参数）：

斜率灵敏度；

峰宽阈值；

峰高阈值；

面积阈值；

噪声阈值；

记录并评估这些参数的改变对回收率计算结果的影响，并在满足回收率标准（通用标准为98.0~102.0%）的参数组合中选择居中的参数组合，以便获得更好的方法耐用性。后续出现分析结果异常（如出现新的未知杂质）需要重新设定积分参数时，这些对参数改变的研究数据，也可以为参数的可修改范围提供依据。

3.5       特殊情况下积分参数的重新设定和验证

分析人员有时候会遇到一些特殊情况。比如，一个通过验证的方法，在常规分析时完全没有问题，但在稳定性测试期间，有时候后会有新的色谱峰、峰型改变、共洗脱峰等异常情况，这种情况下往往原来的分析方法不再适用。

如果是已上市药品出现了上述异常情况，表示这些产品可能不符合规范，并应启动实验室和生产调查，以表征杂质，并确定其来源。这种情况一旦经过确认，企业需要从市场上召回产品，因为一个产品降解特性的鉴定是销售许可的先决条件。

在另一方面，如果异常情况出现在产品开发的早期阶段，同样需要表征杂质和确定其来源。这时候分析人员可能需要修改数据处理方法或者整个分析方法并重新验证。这种情况在药物研发的早期阶段经常发生，可以说分析方法验证应被视为一个过程，而非一次性的工作。

4       结论意见

色谱峰的积分是在现代分析实验室中最经常执行的活动之一。为了获得一致的结果，每次分析数据的积分都需要使用相同的方式。正是出于这个原因，我们建议实验室建立适当的规范和标准操作程序，为准确和科学的积分提供明确的依据。

此外，应该建立明确的程序，规范方法开发和验证阶段的积分参数选择和验证。而经核准的书面方法应该包括合适的色谱积分参数，并指定允许分析人员在必要的异常情况下作出适当调整的范围。一个方法一旦经过验证且被使用，之后对每个色谱数据的积分都需要用这个方法以确保使用相同的参数。而出现异常情况对方法做出调整后，需要重新验证并对异常事件根源进行调查和合理的解释。