对于研发人员和生产企业必须能够克服的技术难题就是制备出稳定的免疫金复合物。

免疫金标记技术是一种将胶体金颗粒与包括抗原、抗体在内的许多蛋白质标记形成免疫金复合物的技术。虽然这种免疫金标记技术呈 现出多种多样的应用方式，但目前主要应用是以快速检测试纸盒的形 式使用于疾病的诊断和监测。

在过去的十年里，基于膜上的快速诊断技术（包括侧向层析和渗滤两种形式）的发展为金标免疫试剂创造了巨大的市场。使用该技术 制备的标记物作为检测系统中的指示试剂使用在检测敏感症、传染病、 环境污染物、毒品、心梗标志物、早孕以及兽医等领域。

如同其他标记结合物一样，获得成功的结果必须通过采用优质的试剂（蛋白质和胶体金）、丰富的生产经验和对标记物产品最终结果分析的完整的知识结构，这需要掌握以下知识要点。

1、蛋白质的标记

在体外诊断应用领域，通常采用抗原或抗体与免疫金结合制备免疫金结合物。采用单克 隆抗体或多克隆抗体，是影响抗体标记的因素之一。

虽然诊断产品中大多数抗体标记采用 IgG 抗体，但 IgM、IgE 和 IgA 抗体也可以成功标记上胶体金。标记时，进一步必须考虑抗体的亚型。在鼠抗IgG亚型中，例如 IgG1 亚型成 功率高，而 IgG3 亚型被证实有技术难度。

将抗原标记胶体金也面临技术难题。将常见的抗原标记上胶体金比较容易。但是受抗原 与胶体金结合方式的影响，金标记覆盖的蛋白反应决定簇小于50%时才能高成功率制备出标 记物。因此，考虑蛋白结合金的方式对标记开发人员非常重要。

2、联接机理

研究人员普遍接受的理论为，三种特异的氨基酸残基在金颗粒与蛋白质的联接作用中发 挥着重要的作用。而赖氨酸、色氨酸和半胱氨酸这三种氨基酸与胶体金联接的作用机理各不相同。

赖氨酸带有较强的正电荷，因而自然吸附带负电荷的金颗粒；

色氨酸主要通过疏水相互作用与胶体金相联接；

半胱氨酸通过 SH-与金表面以共用电子的形式形成配位键。

抗体通过这几种作用力与胶体金颗粒牢固、稳定的、不易分离的结合在一起。在很大程度上，标记成功与否取决于上述三种氨基酸残基在被标记蛋白质上的结合位点。

在某种情况下，氨基酸联接于蛋白质的活性部位，从而干扰蛋白质的反应活性。空间位阻的限制，当这几种氨基酸残基定位于抗体的抗原结合部位或抗原的特异抗体结合决定簇部位时，可能出现这种类型的干扰。如果被标记的蛋白质分子未做特定的处理就几乎不可能克服这种干扰。

为了在免疫检测中获得最佳的灵敏，这三种与标记相关氨基酸的正确结合是非常重要的。就标记抗体来说，这三种氨基酸应定位于 Fc 区，而对于标记抗原，它们应远离抗原的反应决定簇位置。

3，标记方法的调试

为了开发、优化单一标记的胶体金结合物，研究人员通常制备小批量的多达60批次的不 同胶体金结合物。每批次胶体金结合物在某一关键制备步骤上都与其它不同，各批次都被测 试从而确定哪种标记技术对于最终的检测分析可能获得最佳的反应结果。

这类调试应该包括所有可以改善胶体金结合物的灵敏度、交叉反应以及潜在稳定性的技 术参数。典型的测试应包含但不应仅限于抗体工作缓冲液、防腐剂的类型、盐度、表面活性 剂含量、胶体金颗粒的尺寸、封闭剂的类型、总蛋白浓度、结合物工作缓冲液以及结合物的 浓度。为了确定不同封闭剂的效果，建议考虑以下调试内容：

•封闭剂的类型（如酪蛋白、BSA、卵清蛋白、人血清白蛋白、PEG、非特异性 IgG）

•封闭剂的纯度

•封闭剂的含量

•封闭剂对整个测试反应的兼容性

研发人员应该根据在原型产品上的量的调节试验结果确定上述所有试验指标最佳值。最后，无论如何，唯 一的检测方式是将结合物应用于尽可能模仿最终测试条 件制做出来的小型测试条前期产品中。对于基于膜基础 上的检测分析来说，最简易的方法是使用半试纸条形式 来做检测，仅需要使用捕获抗体和纯抗原。在 使用这种简单的测试形式下，很多小批量结合物就能被评估得到比较合适的测定结果，而可以避开一些普遍的问题例如：与干燥相关的技术问题或 者样品缓冲液的问题。

为了满足上述试验的要求，常需要 3mg 抗体或者 5mg 抗原。采用小样样本，能够获得 最优化的胶体金结合物制备参数，并能提供初步的评估样本。一旦使用优质的抗体或者抗原 用于标记，且确定了制备参数，生产商就能容易地制备重复性好和批量化的供选用的结合物。

4，原料的的好坏

应用在制备免疫金结合物的特异性抗体的稳定性主要取决于检测试验的技术条件。对于侧向层析分析，最好的抗体形式是采用一般的单克隆配对。在这类检测分析中，一种单克隆抗体被标 记胶体金作为指示剂，而另一种被固定于硝酸纤维素膜 上作为捕获剂。每种抗体对于抗原表面的不同反应决定 簇都应该是特异识别，并且这些抗原决定簇在空间结构 上距离较远。

多克隆抗体也可以被使用，但至少是必须经过 protein-A 柱层析纯化。在多数情况下，抗体经亲和层析纯化后能制备出具有较高灵敏度和特异性的结合物。这当然取决于符合试验检测可接受交叉 反应的技术要求。

亲和层析纯化 硫酸铵沉淀法或 DEAE 纯化的血清，含有大量的杂蛋白将竞争性结合胶体金颗粒表面的 结合位点。这些杂蛋白拥有高含量的控制蛋白与胶体金结合的三种氨基酸残基，很容易与裸 露的胶体金颗粒结合。出现这种情况时，检测系统中指示剂的灵敏度水平降低。

同理，如果采用经A蛋白或G蛋白柱层析纯化的抗体，然后IgG片段中可能含有大量的非特异性的IgG，而不是需要的特异性IgG.所有的IgG将与胶体金结合，结果可能是低灵敏度。

从亲和层析柱上洗脱下的高亲和抗体应该是高亲和抗体，从而可以产生高特异性的胶体 金结合物。这些抗体可能需要进一步的处理以避免交叉反应。虽然亲和纯化法耗费大量的时 间、经费、血清，但是通过该方法可以获取任何免疫分析必需的关键原料——高质量的结合物。

抗原的标记 成功制备抗原标记物依靠两个因素：控制抗原与胶体金颗粒联接的三种氨基酸残基的空 间位置和抗原大小。

大多数的抗原标记物是被使用在快速检测试纸上，例如血清的双抗体夹心法或竞争法检测。

在这种情况下，通常选择 40nm 胶体金颗粒。直到最近，研究人员发现，40nm 胶体金颗粒标记的蛋白分子量下限为 30KD.然而在某些条件下，通过先进的标记技术可以将该限制 降低到一半至 15KD.使用这些小颗粒标记的主要限制是被标记蛋白必须包含足够数量的赖氨 酸、色氨酸和半胱氨酸残基。抗原常不含有足够的半胱氨酸残基，以至抗原和胶体金颗粒之 间的结合力相对较弱且容易断裂，尤其在样本中存在高亲和力的抗体时。

对于分子量低于30KD的抗原，通常采用其他技术方法，例如标记较小的胶体金颗粒。在检测线处由于胶体金颗粒过小使得可见度低很可能导致灵敏度降低。

对于含有较少或者不含上述三种联接氨基酸残基的抗原，一种有效的解决方法是通过将抗体与载体分子预先联接，比如BSA或KLH.然而这种技术不象说起来那么简单，不是业余 的蛋白化学家所能做到的。必须谨慎考虑使用的联接物类型、联接物长度，半抗原与 BSA 的 摩尔比例和载体分子类型等因素，确保暴露抗原活性反应决定簇部位的结合物可重复制备， 且在测试中蛋白载体胶体金结合物具有最大的敏感性。

5，胶体金颗粒大小

胶体金颗粒大小的选择取决于胶体金结合物的用途。如下段落描述了两个最常用的胶体 金应用领域：显微检测技术和快速诊断技术。

显微检测技术 任何1-40nm的胶体金结合物可以应用于电子显微镜和光学显微镜检测 领域。然而即使在透射电镜放大25万倍的情况下，也不可能观测到1或2nm的胶体颗粒。利用银增强胶体金技术可以让终端客户能够看到胶体金标记的这种较小的抗原性位点。

银增强染色技术是指通过银盐在胶体金颗粒表面沉积，使胶体金颗粒增大到在显微镜下能观察的尺寸。当所有的胶体金颗粒都是同样大小和形状时，该方法具有效率高、易控制的特点且低变异系数。使用如 1-2nm 的胶体金小颗粒时，由于空间位阻较大的胶体金颗粒不能标记的一些抗原决定簇位点，也变得容易接近。因而，一旦确定抗原位置，在银增强染色技术作用下，金标记变得容易联接和形成。

在不采用银增强染色电镜技术的情况下，几个不同的抗原反应决定簇可能被标记在相同的片段上。在这种情况下，采用可分辨出的不同尺寸大小的胶体金标记特异性抗 体，该抗体对不同反应决定簇具有特异识别。

快速诊断技术（侧向层析和渗滤测试盒）。对于该应 用方向，最常用的胶体金颗粒是40nm。在标记IgG时，40 nm的胶体金颗粒提供最大的可视性和最小的空间位阻。分子量为160kDa 的IgG分子，长度大约为 8nm.40-100nm间的胶体金颗粒比较顺利标记到IgG抗体上。比40nm大的颗粒有较大的可视性，但较大胶体金颗粒在1ml溶液时520nm吸光度较小，因此较少在检测线处被捕获。综上所述，同40nm或60nm胶体金标记的抗体相比，较大颗粒的胶体金结合物对1-10ng/ml分析物具有较低的灵敏度。

60nm胶体金颗粒非推荐使用，但可以应用于快速诊断分析。其不同于40nm 胶体金颗粒，颜色偏浅。优质的40nm胶体金为樱桃红色，而60nm胶体金为深粉红色。在某种情况下，样品类型可使膜上残留背景底色，这种轻微的颜色差异可以使信号容易识别。比如，含有胆红素的样本将留下的背景底色，相对褐色，粉红色较红色容易被识别。

如果用于标记分子的分子量小于160kDa，20nm 胶体金颗粒更适合。20nm 胶体金颗粒通常用于标记链霉亲和素、A 蛋白和抗原，这些被标记蛋白的分子量小于60kda。

6，灵敏度 

随着快速诊断技术进步使胶体金结合物的灵敏度得到提高。目前，在大多数快速诊断分析中，检测下限达到1ng/ml.如果优质抗体，可以低到10pg.然而随着银增强技术的发展，检测灵敏度将进一步提高，可能提高10-100倍。后续我将会推出如何提高灵敏度。

胶体金蛋白质结合物的制备过程并非轻而易举的。制备优质的胶体金结合物过程以及缺 乏经验的生产商将面临产品批次的重复性、规模扩大等技术难题。