# 概述

为了防止医疗器械在临床使用时引起不良反应，医疗器械生产商需要根据ISO或者GB/T提供的相关标准进行生物相容性评估。作为生物相容性测试的重要组成部分，体外细胞毒性试验具有通用性，广泛适用于各种医疗器械和材料的评价。该测试并不是单一的试验方法，而是规定一个试验方案，需要在一系列试验步骤中判断，以选出最合适的试验。细胞毒性根据检测终点可以分为：形态观察，细胞增殖，细胞代谢。常见的细胞毒性试验有：细胞 MEM 洗脱试验，MTT细胞毒性试验，直接接触法细胞毒性试验，中性红摄取细胞毒性试验，克隆形成细胞毒性试验，琼脂扩散法细胞毒性试验，相对增殖度法细胞毒性试验，XTT细胞毒性试验等。

培养中的细胞

细胞毒性的判断

细胞毒性测试是最常用的生物相容性测试，主要测试化学物质存在于浸提液中的化学物质可能会对细胞的形态、增殖等方面产生的影响。根据GB 16886.1标准，无论临床用途如何，只要与人直接或间接接触，该测试是推荐做的。在众多生物相容性测试中，细胞毒性试验成本低，测试较为简单，周期相对短，并且不必使用动物。但是该项测试因一般使用体外细胞系，测试系统非常敏感，在生物相容性测试失败的产品案例中细胞毒性占多数，所以生产商应当对该项试验格外重视。在ISO， GB/T， USP，YBB， ASTM中均有具体的细胞毒性测试方法，所谓细胞毒性阳性或者失败，全面的说法应该是在哪一个标准下哪一个试验类型中测试结果为阳性。

常见的细胞毒性试验结果判定总结如下：

MTT 细胞毒性试验显色

影响细胞毒性的因素举例

pH

由于大多数细胞适宜生存的pH为7.2-7.4，偏离此范围可能对细胞生长将产生有害的影响。产品生产或者加工工艺中引入的酸或者碱都会通过浸提进入培养基。一般细胞毒性试验使用的贴壁细胞如L-929，会因pH的波动停止生长或者出现形态变圆、皱缩，从而表现出显著细胞毒性。

金属

用于医疗器械制造的金属，如铜、铬和锌，是人体某些酶发挥作用所必需的。然而，在较高的剂量或者通过某些途径暴露时，这些金属可能导致中毒，在体内引起局部和全身的不良反应。镉，钴、镍、铝和钛离子已被证明具有诱变作用，并根据暴露的剂量和途径被归为具有可能或已证明的致癌元素。金属离子往往还是影响细胞渗透压的主要因素。病患接触到的金属/化合物的剂量决定了该金属/化合物是否会引起毒性，是否含有该类成分不是引起毒性的充分条件。金属离子会氧化攻击细胞内部的重要结构成分，产生活性自由基（例如，活性氧或氮物质），可以对细胞核、蛋白质、和/或脂质产生毒性。例如，Cr显示为强效羟基自由基金属，会导致DNA链断裂。然而值得注意的是，六价铬比三价铬遗传毒性高四倍，研究表明一些金属离子，如Co和 Ni，可以直接与 DNA 聚合酶结合，或者影响其保真度增加将不正确的核苷酸掺入新合成的 DNA链的几率。金属离子导致细胞毒性有很多途径，目前仍在研究中。如下是常见金属离子在L929细胞系中的IC50信息[8]。

增塑剂

市场上许多医疗器械是塑料制品如血袋，管路，注射器，该类产品绝大部分需要是要加增塑剂，如邻苯二甲酸物质，丙二酚，以增加柔韧性和弹性。邻苯二甲酸酯(DEHP)及其代谢产物会引起一定毒性如内分泌紊乱。其替代物还有对苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHT)，偏苯三酸三辛酯(TOTM)，非邻苯二甲酸类还有1,2-环己烷二甲酸二异壬酯（DINCH）、双（2-乙基己基）己二酸、乙酰基柠檬酸三丁酯等。每一种增塑剂从材料中迁移的速率取决于增塑剂和嵌入塑料的特性。不同增塑剂在50%乙醇溶液中从PVC管中提取的迁移率有很大差异，TOTM的释放率比DEHP低20倍。DEHT从PVC浸提出的速度比DEHP小三倍。根据于医疗器械的特性，其他因素也可能影响塑化剂的释放，如PVC输液管路的流速。

最常见的MEHPs，对苯二甲酸单(2-乙基己基)酯，2-乙基己二酸单-2-乙基己二酸，单-邻苯二甲酸异壬基酯，会比母体增塑剂(DEHP, DINP和DINCH)更容易引起 对L929细胞更强的细胞毒性表现。MEHPs已被证明在浓度低至0.01 mg/mL(10µg/mL或10 ppm)时就可能影响细胞活力[8]。

增塑剂举例及其IC50数据信息见下表：

渗透压

渗透压是溶液本身的一种性质，所谓溶液渗透压，简单来说，是指溶液中溶质微粒对水的吸引力。溶液渗透压的大小取决于单位体积溶液中溶质微粒的数目，溶质微粒越多，即溶液浓度越高，对水的吸引力越大，溶液渗透压越高；反过来，溶液微粒少，即溶液浓度越低，溶液渗透压越低。一般来说可溶物均对渗透压有一定的影响。常规培养基能够给细胞毒性试验所用的细胞系稳定的增殖环境，但是当医疗器械浸提液将此平衡打破，细胞的正常增殖将会受到影响，因此没有高毒性或者特定毒性机制的金属离子，酸根离子等也会在某些浓度影响细胞毒性。

如何看待细胞毒性

因毒性皱缩变圆的细胞

作为一个较为敏感的检测终点，是否能通过细胞毒性测试是监管高度关注的问题。医疗器械可能含有醛类、醇类、金属离子、增塑剂或其他可能对其产生细胞毒性作用的材料，这些细胞毒性试验的结果说明了是细胞在接触对某些化学物质有很大的反应。然而，这些效应并不总是与体内全身毒性或临床效应相关，尽管细胞毒性试验有一定的局限，但它是一项强制性试验，在提交市场许可之前，必须对每个医疗器械进行测试。如直接接触法细胞毒性试验、克隆形成法细胞毒性试验、如MEM洗脱试验、中性红试验和MTT试验，可以提供有价值的体外细胞毒性的数据，但往往高估了可能引起的体内不良反应，因此并不总是准确有效的对应临床反应。基于细胞的测试方法所表现出的毒性不一定说明在动物体内或者临床患者身上引起毒性，例如，一些医疗器械浸提出的可溶性金属离子（例如，钠、铜、镍）通过改变细胞生长环境对细胞产生毒性；但是这些离子在临床上患者的耐受性可能足够高其影响可忽略不计。在这些情况下，可通过分析化学方法，如化学表征(可浸提/沥滤物测试)，结合已发表、同行评议的科学论文的现有毒性数据，分析原因，分析试验方法，为患者提供一个毒理学风险和临床安全的评估。