了解固定相常见的键合方式及其修饰，有助于掌握各类型色谱柱的使用条件，提高方法开发效率。

制备反相色谱柱填料常用的方法是在有机硅烷和硅醇的硅胶颗粒表面上发生共价反应，来“键合”生成固定相或者配合基R：

X3-Si-R+≡Si-OH→≡Si-O-Si（X2）-R+HX

（硅烷）（硅烷醇）（最后的固定相）

HPLC柱子的制备可通过几种不同的硅烷-硅胶反应来实现。单体相是反相柱子里使用最广泛的技术，即一个硅烷分子和硅醇基反应。这种一对一键合，使生成的键合相相对完善并且具有很好的重现性。这样制作的填料通常会具有最高的柱效，因为固定相层相对不拥挤，因此溶质分子能够快速扩散进出固定相。相反，多官能团的、高度聚合的固定相则表现出较低的溶质扩散速度和较低的柱效，尤其是在流动相流速较高的情况下。

最初反相色谱填料的存在的主要问题为较窄的pH耐受性和对碱性物质的吸附，由此而造成峰形不对称、保留值不稳定等。针对这些问题，生产厂商采用了一系列技术来达到稳定性高、重现性好、分离效率高的目的。

1  多键键合

目前单体的硅烷-硅胶键合技术主要分为四种：单键键合（Agilent ZORBAX Eclipse系列）、双键键合（Waters SunFire）、三键键合（Waters XSelect系列）、双齿键合（Agilent ZORBAX Extend系列）。单键键合有利于提高传质速率，加快色谱柱平衡。但当pH＜2时，会产生键合相的水解，固定相的流失，溶质分子的保留能力下降。使用多键键合的方式（双键键合、三键键合和双齿键合）可以提高固定相在低pH条件下的稳定性。

备注：其中Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18其硅烷侧链连接了甲基进行保护，因此其耐受pH较Waters SunFire略高。

2  硅胶封端

为了减小不想要的硅烷醇基与溶质的相互作用，反相色谱柱的填料通常需要封端。硅胶封端即将C18反应到硅胶表面上之后，再利用硅烷化方法把小分子的氯硅烷和尚未完全反应的硅羟基进行反应，使之成为不能和碱性化合物作用的硅醚。在制备烷基化硅胶时只有约50%的硅羟基可以反应，剩余的硅羟基可以用封端的方法进行反应，常见的封端试剂是三甲基氯硅烷（TMCS）。较小的配合基（比如，封端的三甲基硅烷）在pH较低时更容易被水解和破坏，这会造成保留时间和选择性的改变。另一方面来说，封端后的色谱柱提高了填料在碱性条件下的稳定性，降低填料流失，同时还能促使色谱柱对极性和碱性化合物的分离且提供良好的峰形。

3  空间位阻保护——侧链烷基

在键合到硅胶表面的十八烷基上引入甲基，异丙基或异丁基，较大的笨重的异丁基侧链干扰了键合相的水解。空间保护对于低pH的分离实验非常有帮助，避免了低pH条件下O-Si键的断裂，但不能用在高pH条件下。具有空间保护功能的固定相可以以多种配合基的形式存在（比如，C8、C18、氰基、苯基），每个配合基在流动相较低的pH条件下均能保持较高的稳定性（pH低至0.8）。其中典型代表为Agilent ZORBAX StableBond系列色谱柱和月旭Ultimate LP系列色谱柱。

4  嵌入极性基团

一般反相色谱柱对强极性和强碱性物质分离较差，在反相固定相的碳链中嵌入极性基团（如脲基、酰胺基、醚基或甲酸酯基），提高对此类物质的选择性，同时极性基团屏蔽了硅胶表面的硅醇基作用，可极大改善峰形，在测定碱性物质时不拖尾。典型代表如采用酰胺基团Waters XBridge BEH Shield RP色谱柱，采用甲酸酯基团的Agilent Zorbax Bonus RP色谱柱；采用脲基ES Industries Chromegabond ODS-P1色谱柱以及采用醚基的Agilent Polaris C18色谱柱等。

另外碳链中存在极性基团，使固定相的亲水性湿润性增强，在使用95%以上的高含水流动相时，不会发生相塌陷。与普通的反相C18和C8柱有不同的选择性，特别是对于酚类等极性物质。解决相塌陷还有另外两种常见方式，①极性封尾，极性的封尾基团能使水浸润并渗透到硅烷表面，保持烷基的伸展，提高极性化合物的保留能力。②降低碳载量，使填料微孔内被流动相填满，提高极性化合物的保留能力。

5  带电填料颗粒

在常规的色谱柱填料表面施予电荷，如Waters CSH系列色谱柱。通过带电修饰，可以在一根色谱柱上实现两种或多种分离机理，如疏水作用和静电作用，即反相和离子交换作用。此外，表面的微量正电荷在低离子强度的分离体系中与被电离的碱性化合物相互排斥，抑制了碱性化合物和残留硅羟基的离子交换作用，从而获得良好的峰形。

参考文献

现代液相色谱技术导论（第3版）

高效液相色谱进展（四）—反相HPLC固定相和色谱柱近年的发展