摘 要： 建立全自动垂直振荡提取-超高效液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中地西泮残留量。采用乙腈作为样品提取溶剂，全自动垂直振荡提取，MCX固相萃取法净化。选取SB-C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μｍ）分离，以0.1％（体积分数）甲酸水和乙腈作为流动相分离，在电喷雾正离子模式和多反应监测模式下检测，外标法定量。结果表明，地西泮的质量浓度在0.1～50.0 ng/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数为0.999 8，方法检出限为0.1 μg/kg，定量限为0.3 μg/kg。在低、中、高3个浓度加标水平下，地西泮的平均回收率为75.6%～88.6%，测定结果的相对标准偏差为2.2％～4.8％（n＝7）。该方法提取效率高，净化效果好，降低了样品基质干扰，提高了方法准确性，可用于鱼肉中地西泮残留量的大批量检测。

关键词： 鱼肉； 地西泮； 全自动垂直振荡； 固相萃取； 超高效液相色谱-串联质谱法

 

地西泮又名安定，属于苯二氮卓类镇静剂，具有镇静、抗惊厥等作用[1]。近年来，一些不法商贩在鱼类的捕捞和运输过程中非法使用地西泮，导致其在水产品中残留[2]。鱼肉是日常生活不可或缺的食物，人体长期摄入含有地西泮残留的鱼肉后，会产生一系列副作用，如易怒、嗜睡、幻听、头痛、乏力等，甚至可能导致药物依赖和耐药性，严重威胁人体健康[3-4]。许多国家已将地西泮列为动物养殖和运输过程中禁止使用的药物，GB 31650—2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》规定鱼肉中不得检出地西泮。目前，从鱼肉中地西泮的监管检验情况来看，检出率较高，是市场监管部门重点监管对象。

地西泮的检测方法主要包括液相色谱法[5]、气相色谱-质谱法[6-7]、液相色谱-串联质谱法[8-12]等。其中，液相色谱-串联质谱法因其在痕量检测中的高灵敏度、强选择性和准确定性等优点，在兽药残留分析中应用最为广泛。地西泮检测的净化方法主要包括QuEChERS原则净化法[7]、HLB固相萃取法[13]、C18 固相萃取法[14]。目前，国家食品抽检细则推荐使用SN/T 3235—2012《出口动物源食品中多类禁用药物残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法》为鱼肉中地西泮残留量检测标准，净化方法为QuEChERS法。在采用以上几种净化方法检测鱼肉中的地西泮残留时，发现存在不同程度的基质干扰，导致回收率偏低。因此亟需研究一种基质干扰低、回收率高的鱼肉中的地西泮检测方法。笔者采用乙腈作为提取溶剂，全自动垂直振荡器提取，MCX固相萃取小柱净化，并通过液相色谱-串联质谱法检测，方法提取效率高，净化效果好，降低了样品基质干扰，提高了方法准确性，可用于鱼肉中地西泮残留量的大批量检测。

 

1、 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱-串联质谱仪：VANQUISH型超高效液相色谱仪及TSQ Quantis型串联四级杆质谱仪，美国赛默飞世尔科技有限公司。

全自动垂直振荡器：V20型，睿科集团（厦门）股份有限公司。

电子分析天平：ME203E型，感量为0.1 mg，梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司。

离心机：ST 40R型，美国赛默飞世尔公司。

高通量全自动固相萃取仪：Fotector-08HT型，睿科集团（厦门）股份有限公司。

数控超声波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超声仪器有限公司。

纯水系统：MiLLi-Q型，法国密理博公司。

旋涡混合仪：XW-80A型，上海驰唐电子有限公司。

地西泮标准溶液：1 000 mg/L，标准物质编号为FE12021903，天津西玛科技有限公司。

甲醇、乙腈：均为色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司。

QuEChERS试剂：内含600 mg硫酸镁(MgSO4)、100 mg乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、40 mg十八烷基键合相硅胶(C18)，上海安谱实验科技股份有限公司。

固相萃取小柱：Poly-Sery MCX型(60 mg，3 mL)、HLB Pro型(100 mg，3 mL)、HC-C18型(500 mg，3 mL)，上海安谱实验科技股份有限公司。

鱼肉粉中地西泮质控样：53.75 μg/kg，编号为QC-1423B-2，大连中食国实检测技术有限公司。

鱼肉样品：市售。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：SB-C18柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μｍ，安捷伦科技有限公司)；柱温：35 ℃；流动相：A相为0.1%(体积分数，下同)甲酸水溶液；B相为乙腈；流动相流量：0.3 mL/min；进样体积：1 μL，梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1   梯度洗脱程序

Tab. 1   Gradient elution procedure

 

 

1.2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI源)；扫描模式：正离子多反应监测模式(SRM模式)，地西泮的监测离子对、碰撞能量和锥孔电压等质谱分析参数见表2。

表2   地西泮质谱分析参数

Tab. 2   Mass analysis parameters of diazepam

 

1.3 系列标准工作溶液的配制

移取地西泮标准溶液1.0 mL于100 mL 容量瓶中，用乙腈稀释并定容至标线，配制成浓度为10 mg/L的标准储备液，于（4±2） ℃保存。移取适量标准储备液，用乙腈逐级稀释，配制成浓度分别为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 ng/mL的地西泮系列标准工作溶液。

1.4 实验步骤

1.4.1 样品处理

称取鱼肉试样2 g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中，加入15 mL乙腈，在垂直振荡仪中以1 000 r/min振荡5 min。然后，以10 000 r/min离心5 min，将上清液转入另一50 mL离心管中。对残渣再加入15 mL乙腈，重复提取并离心一次，合并两次上清液，并用氮气吹干。加入3 mL 5%(体积分数)乙酸水溶液，涡旋1 min。用3 mL甲醇和3 mL水依次活化MCX萃取柱，取备用液过柱，用5 mL 5%(体积分数，下同)乙酸水溶液洗涤，抽干，再用5 mL 10%氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，并在40 ℃下用氮气吹干。用1.0 mL 20%乙腈水溶液溶解残渣，通过0.22 μm滤膜过滤，待上机测试。

1.4.2 实验方法

在1.2 仪器工作条件下，对地西泮系列标准工作溶液进行测定，以保留时间、质荷比和离子比例定性。以目标化合物质量浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。取经样品处理的待测溶液进行测定，将目标物色谱峰面积代入标准曲线方程中，得到样品提取液质量浓度，代入样品质量及提取液体积进行换算得到样品中目标物的质量浓度。

 

2、 结果与讨论

 

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 流动相的选择

比较了甲醇-水、乙腈-水作为流动相的效果。结果发现，甲醇-水作为流动相时，目标物保留时间长，色谱峰形较宽且有拖尾现象；乙腈-水作为流动相时目标物保留时间短，色谱峰形窄且对称。进一步比较乙腈-水中的水相添加0%、0.1%、0.2%、0.5%(体积分数)甲酸对目标物的离子化效率，结果表明，添加0.1%甲酸的离子化效率优于不添加甲酸的流动相，继续增加没有明显变化，因此确定乙腈-0.1%甲酸水为流动相。

2.1.2 质谱条件的选择

离子对的选择、碰撞能量和锥孔电压的优化采用标准溶液(浓度为1 mg/L)直接进样法、全扫描模式扫描和全自动模式优化，从优化结果中选择响应最高的两个离子对作为定量定性离子对，质荷比分别为285.0，193.0、285.0，154.0，碰撞能量分别为32、27 eV，锥孔电压均分别为85 V。

2.2 提取溶剂的选择

采用乙酸铵缓冲液和1%(体积分数)氨水-乙腈溶液作为提取溶剂，需分3次才能基本提取完全，试剂配制复杂，水分含量高，氮吹时间长，处理过程中目标物的损失量较大。考虑到地西泮易溶于甲醇、乙腈和乙酸乙酯，以质控样为实验样品，按照1.4.1样品处理的方法进行实验，比较三种溶剂的提取效果，结果发现，乙酸乙酯的提取液明显浑浊，这可能与同时溶解了蛋白质和脂肪等物质有关，乙腈的提取液最干净，基质影响相对较小，提取效率更高。另外，比较了乙腈、1%甲酸-乙腈、1%氨水-乙腈三种溶液的提取效率，结果发现，提取效率无明显差别，因此直接采用乙腈作为提取溶剂。

2.3 提取方式的选择

全自动垂直振荡仪，可以根据需要设置振荡频率，无需人工操作。比较提取5 min振动频率分别为500、800、1 000、1 200、1 500 次/min的提取效率，每个频率称取3个平行质控样，按照1.4.1样品处理的方法进行样品提取回收率试验。图1为不同振荡频率提取的鱼肉粉中地西泮残留量回收率，从图1中可以看出，当振动频率高于1 000 次/min时，提取效率无明显差别，因此提取频率采用1 000 次/min。

图1   不同振荡频率提取的鱼肉粉中地西泮残留量回收率

Fig. 1   Recovery rate of diazepam residue in fish meal extracted with different oscillation frequencies

比较超声提取法、涡旋提取法和全自动垂直振荡仪提取法对质控样中地西泮提取的提取回收率，提取时间分别为5、10、15、20、30 min。按照1.4.1样品处理的方法进行样品提取回收率试验。图2为三种不同提取方式的鱼肉粉中地西泮回收率，从图2可以看出，超声法提取效率较低，可能是塑料离心管阻碍了超声波的传递，涡旋法提取效率次之，全自动垂直振荡提取法效率最高。综合以上，选择全自动垂直振荡提取法，以实现批量操作，省时省力，操作简单。

图2   三种不同提取方式的鱼肉粉中地西泮回收率

Fig. 2   Recovery rate of diazepam in fish meal by three different extraction methods

2.4 净化条件的优化

鱼肉含有丰富的蛋白质和不饱和脂肪酸，基质比较复杂，有效减少基质效应影响是兽药残留检测的关键。以质控样为实验样品，分别采用QuEChERS原则净化法和C18、HLB、MCX三种固相萃取法净化处理后，进行回收率试验。其中，QuEChERS原则法净化后的提取回收率最高只能达到60%，对该法的各个检验环节进行核查，各个环节均无目标物损失，初步判断，回收率不高的原因主要是基质减弱效应；C18固相萃取法和HLB固相萃取法相对较好，MCX固相萃取法回收率最高。为验证净化方法的优越性，以鱼肉空白样品作为基质配制基质曲线进行基质效应的分析。基质效应ME为基质匹配标准溶液校准曲线斜率与无基质标准溶液校准曲线斜率之比，表3为4种净化方式处理的基质效应，由表3可知，MCX固相萃取法基质效应最弱。

表3   4种净化方式处理的基质效应

Tab. 3   Matrix Effects of Four Purification Methods

注：若ME等于1，表示不存在基质效应；ME大于1为增强效应；ME小于1，为抑制效应。若ME介于0.8~1.2之间，为弱基质效应；当ME介于0.5~0.8之间或ME介于1.2~1.5之间 时，为中等基质效应；当ME小于0.5 或ME大于1.5时，为强基质效应［15］。

 

2.5 专属性试验

称取空白样品2 g，添加地西泮标准品10 ng制成空白加标样品。对空白样品和空白加标样品进行样品处理，在1.2仪器工作条件下注入液相色谱-质谱联用仪进行分析，空白样品和加标样品总离子流色谱图如图3所示。从图3中可以看出，鱼肉基质对地西泮测定无干扰，所建方法适用于鱼肉中地西泮的测定。

图3   空白样品和加标样品总离子流色谱图

Fig. 3   Total ion flow chromatogram of blank sample and spiked sample

 

2.6 线性范围、检出限及定量限

在1.2仪器工作条件下测定地西泮系列标准工作溶液，以地西泮定量离子色谱峰面积(y)为纵坐标，地西泮质量浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线。按照所建立的方法平行测定10次，计算10次测定值的标准偏差，以3倍标准偏差对应的测定值作为检出限，10倍标准偏差对应的测定值作为定量限。地西泮的线性范围、标准曲线线性方程、相关系数、检出限和定量限见表4，由表4可知，地西泮的质量浓度在0.1～50 ng/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数为0.999 8。

表4   地西泮的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

Tab. 4   Linear range，Standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of diazepam.

 

2.7 样品加标回收试验

采用空白基质样品加标法，称取空白鱼肉样品2 g，按照低、中、高的水平添加标准物质，每一个添加水平平行测定7次，按照1.4的试验方法处理，计算鱼肉中地西泮检测的平均回收率，样品加标回收试验结果见表5，由表5可知，地西泮的平均回收率为69.5%～91.8%，测定结果的相对标准偏差(RSD)为2.2%～4.8%(n=7)，表明该方法准确度较高。

表5   样品加标回收试验结果

Tab. 5   Experimental results of sample recovery with standard addition

 

3、 结语

 

通过优化仪器条件和样品提取净化方法，建立了全自动垂直振荡提取超高效液相色谱-串联质谱测定鱼肉中地西泮残留量的方法，该方法提取效率高，采用MCX固相萃取小柱净化，基本消除了基质效应的影响，准确度和精密度良好，可应用于鱼肉中地西泮的批量检测。

 

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引用本文： 单长海，马作江，杨周，等 . 全自动垂直振荡提取-超高效液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中地西泮残留量［J］. 化学分析计量，2024，33（7）：63. (SHAN Changhai, MA Zuojiang, YANG Zhou, et al. Determination of diazepam residue in fish by automatic vertical oscillation extraction with ultra high liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(7): 63.)