细胞毒性检测法（Calcein-AM/PI双染法）是一种常用的细胞活力和毒性评估方法。其原理基于细胞膜的完整性和代谢活性两个关键指标。在实验中，通过使用两种荧光染料Calcein-AM和PI（Propidium Iodide），可以快速准确地评估细胞的状态。

Calcein-AM是一种脂溶性的非荧光染料，可以穿过完整的细胞膜进入细胞内部。在细胞内，Calcein-AM会被细胞内的酯酶水解成为高度荧光的Calcein。只有活着的细胞才能将Calcein-AM水解成Calcein，因此高荧光信号表明细胞的代谢活性和细胞膜完整性良好。而PI是一种核酸染料，只有在细胞膜受损时才能进入细胞内结合DNA并发出红色荧光。因此，当细胞膜受损时，PI会进入细胞并与DNA结合，发出红色荧光信号。

通过同时观察Calcein的绿色荧光和PI的红色荧光，可以区分出三种细胞状态：活着的细胞（只有绿色荧光），死亡的细胞（只有红色荧光），以及受损但仍存活的细胞（同时有绿色和红色荧光）。根据荧光信号的强弱和分布，可以定量和分析不同条件下细胞的存活率和毒性程度，从而评估药物的毒性、细胞培养的质量以及其他相关的生物学研究问题。

一、实验步骤

1、制备工作液

1）首先，将保存在低温环境中的Calcein-AM溶液（2 mM）和PI溶液（2 mM）搁置至室温。

2）随后，取出5µl Calcein-AM溶液（2 mM）和12.5µl PI溶液（2 mM），并加入到含有5ml pH值为7.4的1倍PBS缓冲液中。将混合液彻底混匀。这一步骤完成后，得到的工作液中，Calcein-AM的浓度为2µM，而PI的浓度为5µM。

2、染色

1）首先，使用胰酶-EDTA对细胞进行消化，然后以1000 rpm的速度进行离心5分钟，收集细胞。

2）弃上清，并使用pH值为7.4的1xPBS缓冲液洗涤细胞2~3次，以消除残留的酯酶活性。

3）对细胞进行计数，并调整细胞悬液的浓度至1×10^5~1×10^6细胞/ml。

4）取100µl染色工作液加入200µl细胞悬液中，混匀后在37℃下孵育15-30分钟。

5）使用490±10 nm的激发滤片在荧光显微镜下同时检测活细胞（黄绿色荧光）和死细胞（红色荧光）。此外，使用545 nm的发射滤片仅可观察到死细胞。也可直接在荧光酶标仪下使用适当的滤片进行检测。

二、注意事项

1、鉴于不同细胞系对最佳染色条件的需求有所差异，建议在初次实验时进行梯度实验，以确定Calcein-AM和PI的最佳浓度。

2、由于培养基中的成分如血清含有酯酶，Calcein-AM在遇水时会分解，导致背景信号上升。因此，需要多次离心，并使用PBS缓冲液反复洗涤，直到细胞完全洗净。

3、在进行碘化丙啶（PI）操作时务必注意防护措施。如果碰到皮肤，应立即用自来水进行冲洗。

4、初次使用Calcein-AM溶液和PI溶液时，建议对原液进行分装，以降低反复冻融的频率。

5、由于 Calcein-AM 的稳定性较差，所以此染色工作液必须现配现用，以免影响实验的进行。

如图为Calcein-AM/PI双染法细胞存活测定，活细胞（绿色荧光）和死细胞（红色荧光）