摘 要： 研制了一种集提取、过滤、转移功能于一体的直接萃取色谱瓶，与高效液相色谱法联用，测定烟用水基胶中3种异噻唑啉酮杀菌剂。水基胶样品加入直接萃取进样瓶经涡旋混合后，超声萃取30 min后，无需离心、过滤、转移等传统步骤，直接用高效液相色谱检测。3种异噻唑啉酮杀菌剂的质量浓度在0.05~2.50 μg/mL范围内与色谱峰面积具有良好的线性关系，相关系数均大于0.998，检出限为0.33~0.55 mg/kg，定量限为1.10~1.83 mg/kg。测定结果的相对标准偏差为1.3%~3.8%（n=6），回收率为90.2%~104.4%。采用该方法对多个水基胶样品进行检测，检测结果与烟草行业标准溶剂萃取过滤法相吻合。该方法可作为一种快速准确测定水基胶中异噻唑啉酮杀菌剂的技术进行推广。

关键词： 水基胶； 异噻唑啉酮； 高效液相色谱

 

水基胶是以水分散型溶剂为介质，常温下呈中性(或者弱酸性)的黏性混合乳液，其安全性备受关注[1]。异噻唑啉酮类化合物作为广谱高效杀菌剂，目前广泛添加到烟用水基胶中起到杀菌防腐的作用[2-3]，但异噻唑啉酮类化合物存在可能导致皮肤致敏反应、皮肤灼伤或哮喘的安全隐患，因此水基胶中异噻唑啉酮类化合物含量的监控是烟草行业非常关注的安全性问题。

目前烟用材料涉及的异噻唑主要为2-甲基-3 (2H)-异噻唑啉酮、5-氯-2-甲基-2H-异噻唑-3-酮、1,2-苯并异噻唑基-3 (2H)-酮，在烟草行业和其他行业已经有很多方法用于这类异噻唑啉酮杀菌剂的测定，例如液相色谱法[4-5]、气相色谱法[6]、液相色谱-质谱联用法[7‒10]、气相色谱-质谱联用法[11‒13]。这些方法包括烟草行业标准YQ/T 86—2018 《烟用水基胶、接装纸、内衬纸、滤棒成型纸和卷烟纸中异噻唑啉酮类杀菌剂的测定　高效液相色谱-串联质谱法》对水基胶的预处理均需要在溶剂萃取后及上机前进行离心除去沉淀物，再用针式滤膜过滤后进行色谱或色谱-质谱分析，有些方法甚至还需要用固相萃取富集或净化，预处理步骤繁琐，不利于快速批量高通量检测。另外，YQ/T 86—2018采用的串联质谱法所需仪器昂贵，制约了该检测方法在水基胶生产企业的应用。

笔者在参考文献[14‒15]的基础上，研制了一种集提取、过滤、转移功能于一体的直接萃取色谱瓶，与高效液相色谱（HPLC）法联用，建立了一种涡旋辅助直接进样-高效液相色谱法测定烟用水基胶中异噻唑啉酮杀菌剂的方法，大大简化了样品预处理过程以提高检测效率。

 

1. 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱仪：Agilent 1200型，美国安捷伦科技公司。

电子天平：AG104型，感量为0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

超声仪：DS-7510DTH型，上海生析超声仪器有限公司。

超纯水仪：Milli-Q型，美国密理博公司。

2-甲基-3(2H)-异噻唑啉酮（MI）、5-氯-2-甲基- 2H-异噻唑-3-酮（CMI）、1,2-苯并异噻唑基-3(2H)-酮（BIT）标准品：纯度（质量分数）均为99%，CAS号分别为2682-20-4、26530-03-0、2634-33-5，北京百灵威科技有限公司。

甲醇：色谱纯，天津迪马科技有限公司。

水基胶样品：工业级，浙江中烟工业有限责任公司提供。

实验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

色谱柱：Acclaim Explosive E2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦科技公司）；进样体积：10 μL；柱温：30 ℃；流量：0.9 mL/min；流动相：水-甲醇；检测器：紫外检测器；检测波长：MI、CMI均为275 nm，BIT为318 nm；梯度洗脱程序见表1。

表1   梯度洗脱程序

Tab. 1   Gradient elution program

 

1.3 试验步骤

1.3.1 标准溶液配制

MI、CMI、BIT单一标准储备液：精密称取MI、CMI、BIT标准品各10.0 mg，分别用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，配制成质量浓度均为1 000 μg/mL的单一标准储备溶液。

混合标准储备液：分别精密量取MI、CMI、BIT单一标准储备液各0.5 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成质量浓度为5 μg/mL的混合标准储备液。

系列混合标准工作溶液：分别精密量取1.0、5.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mL混合标准储备液于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释成3种异噻唑啉酮质量浓度分别为0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.50 μg/mL的混合标准工作溶液。

1.3.2 样品预处理

样品分别采用溶剂萃取过滤法、涡旋辅助直接进样法进行预处理。

溶剂萃取过滤法：参照YQ/T 86—2018进行预处理，精密称取烟用水基胶0.3 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密量取5 mL水加入锥形瓶，振荡分散后准确加入20 mL甲醇，盖紧瓶塞，350 W超声萃取30 min，移取1.5 mL萃取液于2 mL离心管中，10 000 r/min离心5 min。离心后的上清液过0.45 μm有机相滤膜，待测。

涡旋辅助直接进样法：精密称取烟用水基胶0.01 g于直接萃取进样瓶外管中，精密量取150 μL水加入外管，再加入甲醇450 μL，将带有过滤筛板的内管固定在外管的管口，涡旋10 s接着350 W超声萃取30 min后压下内管，提取液通过筛板进行过滤后进入内管，直接上机测样。

1.3.3 定量方法

采用高效液相色谱法测定，以色谱峰面积外标法定量。

1.4 直接萃取进样瓶

直接萃取进样瓶结构主要分成外管和内管两部分，外管负责上样和萃取溶剂，内管底部带有密封圈和过滤筛板，顶部带螺纹瓶盖，尺寸和垫片与普通色谱进样瓶口一致，可以直接供高效液相色谱仪上样检测。

直接萃取进样瓶具体的预处理过程：（1）称取水基胶于外管中，添加水-甲醇；（2）将带有过滤筛板的内管固定在外管管口，因为有密封圈的存在，外管处于密封状态，可涡旋10 s混匀溶剂后再超声萃取；（3）超声萃取结束后，将内管压下，提取液通过筛板进行过滤后进入内管，可以直接上机测样。直接萃取进样瓶具备提取、过滤、转移功能，进样瓶结构和直接进样预处理过程如图1所示。

图1   进样瓶结构和直接进样预处理过程示意图

Fig. 1   Direct extract-sampling bottle and its procedure of the pretreatment

 

2. 结果与讨论

 

2.1 色谱条件的优化

以水-甲醇为流动相，采用等度洗脱无法分离水基胶复杂基质中的异噻唑啉酮，而采用1.2优化的梯度洗脱程序、流量及柱温的条件后，在25 min内得到良好的分离。

2.2 直接萃取进样与传统溶剂萃取过滤进样比较

水基胶中聚合物主要以胶体或悬浮粒子形式存在，在甲醇/水溶剂中会均匀分散，所以烟草行业标准YQ/T 86—2018采用溶剂萃取过滤后，色谱进样分析前还需要高速离心和针式过滤，这不仅需要使用高速离心机外，还需要消耗针筒、针头过滤器等一次性耗材。

采用1.4研制的集提取、过滤、转移功能于一体的直接萃取进样瓶，整个预处理和进样过程均在直接萃取进样瓶中进行，避免了离心、过滤和转移溶液，整个预处理步骤得到了简化，所消耗的有机试剂也大大减少。

2.3 萃取条件优化

水基胶需要先加水分散后，进行萃取，考虑到直接萃取进样瓶体积小，许可添加的萃取溶剂总量仅为600 μL，而超声萃取相对机械震荡萃取更易操作，后续萃取条件选用超声萃取进行条件优化。

2.3.1 萃取溶剂优化

参考YQ/T 86—2018标准，选用甲醇-水相萃取水基胶中的异噻唑啉酮，考察了600 μL萃取溶剂在甲醇-水（v∶v）比例分别为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1的萃取效果见图3。由图3可知，甲醇比例太高，不利于水分散效果；甲醇比例太低，萃取效果太差；在甲醇-水（v∶v）比例为3∶1时，3种异噻唑啉酮的萃取效果最好，因此选定先加水150 μL分散，再加入甲醇450 μL进行超声萃取。

图3   甲醇-水在不同比例下的峰面积

Fig. 3   Peak areas of methanol-water at different ratios

2.3.2 萃取时间优化

考察了超声萃取时间分别在10、20、30、40、50 min的萃取效果见图4。

图4   不同萃取时间下的峰面积

Fig. 4   Peak areas at different extraction times

由图4可知，当超声萃取时间为10～30 min时，萃取出来的异噻唑啉酮杀菌剂含量变多；当超声萃取时间为30～50 min时，由于萃取时间过长导致基质效应变严重，检测出来的异噻唑啉酮杀菌剂峰面积略有降低，因此选定超声萃取时间为30 min。

2.3.3 萃取温度优化

于水基胶中加入水150 μL分散，再加入甲醇450 μL，在超声萃取30 min的条件下，考察萃取温度分别为20、30、40、50 ℃条件下的萃取情况见图5。由图5可知，当萃取温度为20～40 ℃，萃取效果变化不大；当萃取温度为50 ℃时，萃取效果变差。综合考虑，超声萃取可以在常温下进行。

图5   不同萃取温度下的峰面积

Fig. 5   Peak areas at different extraction temperatures

2.4 方法评价

2.4.1 异噻唑啉酮杀菌剂的线性方程、方法检出限和定量限

移取系列混合标准工作溶液，在1.2仪器工作条件下进样，以3种异噻唑啉酮杀菌剂的质量浓度（x）为横坐标，对应的色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制标准工作曲线。按照信噪比(S/N)分别为3、10时计算方法检出限和定量限。3种异噻唑啉酮杀菌剂的质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限见表2。由表2可知，3种异噻唑啉酮杀菌剂的质量浓度在0.05~2.50 μg/mL范围内与色谱峰面积具有良好的线性关系，相关系数均大于0.998，检出限为0.33~0.55 mg/kg，定量限为1.10~1.83 mg/kg，可满足烟草行业实际检测的要求。

表2   3种异噻唑啉酮杀菌剂的质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限

Tab. 2   The linear ranges of the mass concentration, linear equations, correlation coefficients, detection limits, and quantification limits of three isothiazolinone fungicides

 

2.4.2 准确度和精密度

取某水基胶样品，分别加入低、中、高3个浓度水平的异噻唑啉酮，每个加标水平平行测定6次，计算回收率及测定结果的相对标准偏差，以考察方法的精密度及准确度，试验结果见表3。由表3可知，测定结果的相对标准偏差为1.3%～3.8%，平均回收率为90.2%～104.4%，表明该方法具有良好的精密度和较高的准确度。

表3   加标回收与精密度试验结果

Tab. 3   Results of spiked recoveries and precision test

2.5 样品测定及结果比对

抽取水基胶样品1#、2#、3#，分别以YQ/T 86—2018和涡旋辅助直接进样进行预处理和仪器分析测定，试验结果见表4。由表4可知，所建方法（直接萃取进样）与现行烟草行业标准方法YQ/T 86—2018（溶剂萃取过滤法）检测结果的相对偏差不大于3.7%，表明两者测定结果具有一致性，所建方法结果准确、可靠，可作为一种快速准确测定水基胶中异噻唑啉酮杀菌剂的方法推广。

表4   烟用水基胶样品中异噻唑啉酮含量

Tab. 4   Concentration of isothiazolinone preservatives in adhesives

 

3. 结语

 

研制了一种集提取、过滤、转移功能于一体的直接萃取色谱瓶，与高效液相色谱法联用，建立了测定烟用水基胶中的2-甲基-3(2H)-异噻唑啉酮、5-氯-2-甲基-2H-异噻唑-3-酮、1,2-苯并异噻唑基-3(2H)-酮的方法。水基胶样品加入直接萃取进样瓶经涡旋混合后，超声萃取30 min后直接上机检测，无需离心、过滤、转移等传统步骤，整个预处理和进样过程均在直接萃取进样瓶中进行。预处理步骤相对现有行业标准得到简化，同时有机试剂的消耗也大大减少。结果比对表明，该方法检测结果与现行行业标准具有一致性。该方法简单、快速、准确、环境友好，可作为一种快速准确测定水基胶中异噻唑啉酮杀菌剂的方法推广，在卷烟生产企业和水基胶厂家的水基胶品质控制有一定应用价值。

 

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