说到分析方法开发，目前国内大多数研究人员面对的都是仿制药的方法开发，也就是说有一定研究基础的方法微开发。已上市的仿制药或多或少都有一定的文献参考，比如各国药典、国内外研究文献、原研专利等等。这类方法的建立，大多基于已有的研究资料进行确认、优化，不能称为完整的方法开发。对于一个新的小分子原料药，没有可供参考的文献时，如何进行方法的开发呢？本文以有关物质方法开发为例，对新的小分子原料药的方法开发思路进行了简单的梳理，分为以下几个部分，希望对大家有所启发。

一 、理化性质研究

主要包括性状、晶型、熔点、溶解性、pKa、logP、引湿性、分子极性大小、BCS分类等。

二 、 杂质谱分析

主要是根据合成路线来分析杂质谱，包括工艺杂质（中间体、副产物等）、残留溶剂（合成及精制过程用到的所有溶剂）、无机杂质（合成中用到的金属催化剂等），降解杂质（根据反应机理推断及强制降解研究来确定）。

杂质谱分析是分析方法开发及药物质量标准建立的关键，因为研发是一个系统工程，需要统筹设计，就像QbD作为处方工艺开发的工具，指导我们研究的全面性，防止顾此失彼。在进行实验前，全面系统的杂质谱分析，可以让我们全面了解目标分析物，做到有的放矢。

当然在药物申报过程中，我们也必须考虑到各国药典标准的要求，需进行充分的调研，对杂质谱进行系统的分析。

残留溶剂和无机杂质方法开发相对比较清楚，这里不做探讨，主要阐述工艺杂质和降解杂质的有关物质分析方法的开发。

三 、开发过程

（一）稀释液的筛选

1 、 关键性能指标：对检测无干扰、溶解性好（溶解能力大于5倍目标溶解量）、溶液稳定（至少保证在分析检测时间段内是稳定的）、无溶剂化效应、经济环保等。先初筛再根据流动相考察情况调整，尽量选择和流动相组成接近的。

2  、流动相、色谱柱、检测波长等关键色谱参数的筛选

 关键性能指标：分离度好（主峰附近杂质同主峰能基线分离，分离度大于1.5；已知杂质之间能充分分离等）、主峰无杂质包裹（峰纯度符合要求）、无杂质未保留或未洗脱、已知杂质和未知杂质能准确定量、各目标分析物峰型及保留时间稳定、方法耐用性良好等。

（二）如何做？主要基于理论和实践经验来设计

1  、流动相pH和缓冲盐  对于极性分子，pH通常选择pKa±1以外的区域，主要保障分子处在稳定的解离状态。缓冲盐根据目标分析物吸收波长情况和需要的缓冲范围来确定，比如对于低波长吸收的（220nm以下），优先基线噪音小的磷酸盐缓冲液，不选基线吸收大的有机缓冲盐。

2 、 流动相有机相种类  结合目标分析物的吸收波长、洗脱难易、选择性要求等，选择甲醇、乙腈、四氢呋喃或者它们的混合溶液。

3  、色谱柱   色谱柱对选择性、分离度、峰型、保留时间等方面影响最大，选择合适的色谱柱对方法开发事半功倍。可以根据分子极性大小、分子结构特点，色谱柱本身的性能特点（比如载碳量、比表面积、是否封尾、封尾方式、适用pH范围、适用水相比例等），初步拟定色谱柱选择范围。先粗再细，并根据实验结果灵活调整。

4  、检测波长  波长的选择影响到最终分析目标检测的准确性，所以需要认真评估。一般开发方法时会使用DAD，并采用200-400nm范围扫描，可以利用三维图谱选择主峰和杂质具有等吸收的波长（即相同浓度吸收接近的波长）。但目标分析物可能数量多，结构差异大，发色团不同，等吸收波长不容易统一，可能需要平衡方法策略，比如选择双波长、部分已知杂质采用校正因子或外标法定量等等。

（三）是否有杂质漏检？分为以下几种可能情况，这里分别阐述。

1  、杂质极性较大、保留弱，随溶剂峰一起洗脱

排查方法：降低洗脱强度，比如起始流动相减小有机相比例，观察是否有杂质多出；选择对极性保留强的色谱柱，比如waters T3色谱柱；如果方法兼容可以采用LCMS，通过质谱检测器来确认溶剂峰处是否有其它物质。

2  、杂质包裹在主峰里面

排查方法：采用DAD检测器，考察峰纯度（对于杂质紫外吸收图谱同主峰接近的无法辨识）；采用LCMS，利用质谱检测器检测主峰纯度（可信度高）。

3  、杂质保留在色谱柱中未洗脱出来

排查方法：增大有机相比例和延长洗脱时间（增加洗脱强度），观察是否有新杂质。

4  、杂质在选定波长下无紫外吸收

排查方法：采用DAD检测器在200-400nm范围检测，观察三维图谱是否存在新的杂质；采用LCMS，同时对比质谱图和紫外图，观察是否有新的杂质。

四、结语

以上是笔者对新分子原料药方法开发思路的一个简单梳理。实际操作中，目前仪器厂家，比如安捷伦和Waters公司都推出了专门用于分析方法开发的色谱系统，柱温箱可以同时兼容多根色谱柱，流动相系统可以在线混合调节不同pH，检测器配置了正交检测器（比如DAD和质谱检测器）。方法开发时可以同步筛选多根色谱柱和多个不同流动相。方法开发效率得到大幅度提升，并且仪器软件还会针对筛选的结果进行统计分析，给出最优的分离条件。优秀的硬件平台加上先进的设计理念，方法开发工作将变得更加高效、便捷。