药品是特殊商品，安全、有效、质量可控是其内在属性。影响药品安全性的关键是杂质，包括无机杂质、有机杂质和残留溶剂。建立专属性强、准确性高、耐用性好的分析方法（图1）是杂质研究与控制的重要手段。其中，无机杂质和残留溶剂具有通用性，杂质种类是明确的，因此分析方法的开发相对简单。而有机杂质也就是常说的有关物质，因API结构和工艺特征而异，且多数有关物质是未知的，因此有关物质方法的方法开发难度更大，是质量研究的重头工作。本文结合工作经验探讨有关物质分析方法开发的流程与技巧。
图1 分析方法目标概况（ATP）
在众多分析方法中，高效液相色谱法因具有适用范围广、操作简便的优点，已成为有关物质测定最常用的方法，因此本文以高效液相色谱法方法开发为例，其他方法也可以类比。
Step1 分析对象确定
在接到一个有关物质分析方法开发的任务时，首先要对反应线路和工艺进行了解，并与合成研究员共同探讨可能的工艺杂质和降解杂质，目的是要确认在所要开发的方法中，需要考虑的杂质有哪些？哪些杂质是需要重点考察（需达一定的线性、精密度、准确度），哪些杂质仅需满足分离度要求即可，在方法开发之前需要对这些信息有大致的判断。
Step 2 理化性质研究
在确认了需要控制的杂质后，要对API的理化性质进行研究，例如解离常数对流动相pH设置有提示作用；分配系数可以对分析系统和保留时间有预判；结构中是否存在共轭结构等有助于检测器类型的选择。
Step 3分析系统选择
分析系统的选择取决于2方面，一是待分析化合物的极性特征，二是所选择色谱柱填料的类型。绝大多数情况下，都可以采用反相液相进行。当待测化合物极性较大且通过调整有机相比例、添加离子对试剂或者更换Hilic色谱柱都无法得到较好的分离效果时可以考虑正相色谱法，另外如果需要分析异构体杂质，并且所选择的手性柱为正相填料，那么也应该选择正相色谱法。
Step 4 初始方法建立
在分析系统确定后，就可以建立初始分析方法了。首选有机相与水作为流动相，采用最简单的匀速线性梯度，考察主峰及各杂质的分布情况，对方法有机相的初始和终点比例有大致的判断，同时对样品进行多波长扫描，选择可以同时兼顾主成分和杂质分析的波长。如果在有机相和水作为流动相时化合物峰型极差可以考虑将水更换为酸溶液或缓冲盐。
Step 5 方法优化
通常初始方法的性能不能达到我们所设定的要求，需要继续进行优化，主要是优化分离度。分离度计算公式为：
通过公式可知，分离度是理论塔板数、选择性和保留因子的公式，凡是能影响理论塔板数、选择性和保留因子的因素都是方法优化的对象，包括色谱柱、流动相种类、pH、添加剂种类和浓度、流动相梯度、柱温等。
一般情况下，首先优化无法量化的色谱柱和流动相种类，然后再对流动相pH、添加剂种类与浓度、流动相梯度、柱温等条件进行优化。
5.1 色谱柱
1）色谱柱是液相系统的核心，更换色谱柱填料类型（图2）对分离度产生的影响是最大的。
反相色谱柱常用的填料包括C18、C8、C4、氨基柱、苯基柱等，正相色谱柱常用的填料包括多糖或淀粉键合柱，氨基柱等。填料选择取决于待分析化合物的极性特征以及是否含有特定基团，例如非极性及弱极性化合物适用于C18 色谱柱，中等极性化合物可使用氨基柱，极性化合物可尝试Hilic色谱柱或正相色谱柱，芳香族化合物可以尝试苯基柱。
除了填料类型，碳载量和比表面积也是影响保留的重要因素，碳载量高的色谱柱保留强，如果筛选填料类型后分离仍不理想可以考虑尝试碳载量更高的色谱柱，也许会有较好的效果。
在色谱柱筛选时应关注不同批次填料的差异，这将影响常规测样期间更换色谱柱后检测结果的重现性，严重时甚至可能会导致方法终止。
图2 色谱柱填料类型
2）色谱柱粒径和内径越小峰型越尖锐，容易获得更好的分离度，但同时色谱柱背压也会越高，在选择这些参数时要考虑仪器的压力耐受范围。
3）柱长与分离度成正比，色谱柱越长，获得的理论塔板数越高，分离越好，但待分析物保留时间会相应增加，分析时间可能会延长。
5.2 溶剂种类
溶剂类型会影响选择性。反相色谱中常用的有机相为乙腈、甲醇，有时也会加入适量的THF以增加选择性，添加量一般不超过10%，否则可能会耗损液相色谱仪。其中乙腈的洗脱能力更强，且截止波长短，粘度低，惰性好，是有机相的首选。甲醇与乙腈洗脱能力不同，与待测组分及固定相的相互作用方式也不同，因此待测组分在甲醇中与在乙腈中可能呈现不同的洗脱顺序或分离效果，必要时可以将乙腈-甲醇以一定比例混合作为有机相。
5.3 流动相pH
目前大多数药物具有可电离基团，流动相pH可明显影响待分析化合物及相关杂质的解离状态，酸性化合物在酸性条件下具有更好的峰型和保留，碱性化合物在碱性条件下具有更好的峰型和保留，在pH优化过程中除了要考虑待分析物的结构特征外，要重点关注色谱柱所能耐受的使用范围，大多数色谱柱填料都是硅胶基质的，即便键合了惰性基团，碱性条件下也很容易溶解，因此使用高pH时一定要做详细的技术咨询。
5.4 流动相添加剂种类及浓度
1）流动相添加剂种类包括酸和缓冲盐，采用哪种添加剂需要通过试验结果来选择，通常情况下缓冲盐使用更普遍。
2）添加剂浓度可能影响待测组分的峰型和保留，一般从低浓度开始，逐步增加浓度，当峰型和分离不再改善时停止优化，以获得可接受分离效果所需的最低浓度作为添加剂浓度。
5.5 梯度
流动相梯度变化可改变溶剂强度，是改善分离的重要手段。梯度设置可依据样品中杂质分布情况来调节，通常分布密集的地方可以采用更低的变化速率，杂质稀疏的地方可以采用更快的变化速率，但也需要注意由于不同组分对有机相变化的敏感程度不同，也不是一味降低梯度变化速率就能获得更好分离，有时可能获得相反的结果。建议在梯度筛选的开始时多设置不同的变化速率，整体考察各待测组分对梯度的敏感程度，总结出规律，再有针对性的设置梯度。
5.6 柱温
随着液相色谱的普及，柱温作为改善分离的辅助手段的重要性越来越受到重视。柱温通过两种方式影响分离度，一是高温可使峰型更尖锐，从而改善分离度；二是高温可使各待测组分保留时间提前，且不同的组分对温度敏感程度不一样（有研究表明温度对可电离化合物的影响高于不可电离化合物），从而改变分离度，但是分离度可能变好也可能变更差，需通过试验数据进行确认。此外，由于高柱温可使保留时间更短，提高分离速度，因此可以缩短分析时间，提高工作效率。
Step 6 方法预验证
分析方法开发完成后，需要对所开发的方法进行简单的预验证，以便为后续方法学验证提供一个较好的输入。一般情况下可以对专属性（降解试验）、定量限、检测限、回收率、溶液稳定性等做初步考察，同时结合方法开发过程中对方法特性的理解，对可能影响方法性能的条件进行适当的耐用性考察。
结束语
有关物质方法开发的总体原则是在保证专属性、灵敏度、准确度等必要条件下，尽量缩短分析时间，以提高检测速率，同时实现方法的经济性。
方法开发是在工艺未完全确认的阶段开展的，当工艺发生变更时要仔细评估，随时调整方法，确保方法能适用于杂质谱研究，为后续安全性评价奠定基础。
分析方法开发没有绝对的终点，是否终止开发取决于方法目标的设定，能达到设定的目标即可，无需花费更多的时间寻找更优的方法，因为当你这样做的时候你会发现方法开发的工作将永远无法结束，所以不要恋战。
一旦分析方法建立并经过验证，就要建立基于风险评估和可用数据的控制策略，并在日常检样中持续监控方法性能，必要时进行方法改进。
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