不溶性微粒指不溶于水和有机溶剂，非代谢性的，肉眼所看不见的颗粒物。不溶性微粒粒径一般小于50μm的微粒，可见异物指在特定条件下目视即可观测到的不溶性物质，其粒径或长度通常大于50μm。可见异物/不溶性微粒的控制是保证注射剂安全使用的一项重要指标。对于生物制品注射剂而言，蛋白质产品中的蛋白质有聚集并形成不溶性微粒的倾向，且这种聚集会影响药效，增加潜在的免疫原性风险。因此，不溶性微粒/可见异物是生物注射剂的关键质量属性之一。本文对生物制剂中不溶性微粒/可见异物产生原因、检测方法和控制策略进行分析，以期为生物注射剂研发提供参考。
1. 产生原因
1.1外源污染
如原辅包中未清除的金属屑、玻璃屑、纤毛、块状物等，设备清洁不当，人员、环境中带来的一些颗粒等。
1.2制剂降解
制剂储存期间产生不溶性微粒/可见异物，例如，氧化、水解，高温引起活性药物成分与辅料相互作用，药物包材相互作用产生的可浸出物，包材中硅油的脱落等。
1.3界面应力
界面应力可以发生在所有界面，例如，在含有硅油作为润滑剂的样品的液-液界面，如预填充注射器，蛋白质可以聚集在油滴表面。在溶液和顶空交界面的静脉液袋中，蛋白质在液-气界面上聚集，储存或样品冻融时在固液界面聚集等。
1.4聚山梨酸酯降解
处方中通常添加表面活性剂以保护蛋白质免受界面应力的影响。最常用的表面活性剂包括聚山梨酸酯20和聚山梨酸酯80以及波洛沙姆188。聚山梨酯是一种非离子表面活性剂，由于多种不同的脂肪酸作为侧链存在，聚山梨酯的组成是高度不均匀的。已知聚山梨酸酯可以通过水解和/或氧化降解，产生不同的不溶性降解产物，导致不溶性微粒/可见异物产生。此外，酶水解被认为是在抗体药物中聚山梨酯降解导致蛋白聚体微粒形成的根本原因。一些脂肪酶、酯酶、宿主细胞蛋白残留磷脂酶 B2 都可以在酯键处裂解聚山梨酯，从而形成游离脂肪酸，由于游离脂肪酸在水溶液中溶解度差，当低温保存时，制剂中形成不溶性微粒/可见异物，对其蛋白质的长期稳定性产生一定影响，从而影响药品的有效期。
2. 检测方法：
2.1不溶性微粒检查法
《中国药典》2020 年版三部采用光阻法和显微计数法。USP<1787>建议使用4-100μm粒径范围内的形态测量，这可能有助于区分粒子来源为固有的、内在的/外在的，以降低不溶性微粒带来的风险。但由于其检测原理，无法区分不同类型的颗粒，例如蛋白质聚集体、硅油液滴等。此外可能无法检测到半透明的蛋白质聚集体，从而低估了样品中的总颗粒。近年来流行的流式成像显微镜(FIM)技术通过使用直接对颗粒进行成像的FIM不仅可以获得形态信息还能够将蛋白质聚集体与其他颗粒（如硅油滴、气泡和其他外在和内在的颗粒杂质）区分开来。
2.2 可见异物检查法
《中国药典》2020 年版三部采用灯检法和光散射法。然而，除了大小之外，可见性的限制还取决于许多因素包括颜色、形状、透明度、反射率以及检测人员的培训。要想了解粒子具体类型通常需要将他们分离后进行表征。任何一种分离方法都应注意需要去除干扰(例如，用水冲洗样品的可溶性赋形剂)。物理方法包括显微表征和成像方法。化学鉴定通常涉及光谱技术，如傅里叶变换红外(FTIR)和拉曼光谱，它们适用于识别有机材料，如弹性体，纤维和产品相关颗粒(蛋白质，辅料)。这些都有助于确定颗粒来源、引入途径。
3. 控制策略
3.1 早期开发阶段
充分了解药物的相关性质，评估可能产生的颗粒类型。如表面活性剂聚山梨酸酯20和聚山梨酸酯80降解产生颗粒，可以选择纯度较高的聚山梨酸酯，尽量减少降解脂肪酸的产生。包材方面，硅油的存在可能会促进颗粒产生，应充分评估考察硅油的用量对产品的影响。必要时可以选择无硅油的产品。工艺优化，选择合适的冻干工艺，尽量避免冷冻应力导致的蛋白聚集。
有些情况下，颗粒的产生是不可避免的，一些上市生物制品中就申称含有一些颗粒。如Bristol-Myers Squibb公司生产的Erbitux®可能含有少量易见、白色、无定形的西妥昔单抗颗粒。Amgen公司生产的Vectibix®可能含有可见的半透明到白色，无定形的蛋白质颗粒。
这种情况下就需要对粒子进行鉴别，评估产生的数量和尺寸，并进行毒理学和安全性评估，以确定不会对患者产生安全性的影响。
3.2 生产过程中控制
应关注产品生产线上可能带来的异物，如对包材清洗进行验证，环境监测，人员培训。评估药液在生产转移过程中界面应力的影响，如对搅拌速度、灌装速度进行合理的控制。检测灌装或装配线中的故障，如玻璃破裂或漏油。在生产后，每批产品都要进行100%密封性检验，及时发现外观缺陷，剔除不合格产品。
3.3 稳定性研究
大多数固有的粒子现象产生于稳定性阶段，可以通过影响因素加速试验及早发现粒子的产生情况。在整个稳定性研究期间按照药典要求进行可见异物和不溶性微粒的监控，并进行趋势分析。对超出药典标准要求的颗粒进行表征，确定颗粒来源和控制措施。依据稳定性研究数据确定产品储存的条件和包材的相容性，为产品有效期制定提供依据。关注使用中稳定性，特别是需要进一步稀释的产品，由于表面活性剂浓度的降低和一些操作产生的界面应力会导致使用过程中颗粒的产生。冻融应力也可能会导致颗粒的增加。模拟运输试验，评估运输过程对颗粒的影响。
3.4 上市后监控
产品上市持续监控对于确定开发阶段制定的质量标准非常重要。任何在生产过程中引入的变化(例如，配方变化、包材的变更等)应彻底评估其对颗粒形成的影响。此外，在研发阶段发现颗粒的情况下，上市后批次应密切观察，以检测与研发批次之间的差异。同时，通过上市后大批量的使用人群，进一步评估产品的安全性。
总结：
综上所述，生物注射剂在产品开发设计阶段就应充分评估可能产生不溶性微粒/可见异物的因素。生产过程中尽量避免外来异物的污染。通过稳定性研究发现储存期间和使用过程中可能产生的不溶性微粒/可见异物。上市后持续监测，及早发现上市产品与研发产品的差异。一旦发现了超过标准的不溶性微粒/可见异物需要进一步检测分析颗粒类型及来源，制定合理的控制策略。对于无法避免的产品固有不溶性微粒/可见异物需要进行毒理评估产品安全性，并在临床中持续观察产品对人体安全性的影响。
近年来，各种新型生物药的开发火热，如LNP，细胞治疗药物等本身就具有颗粒的性质，如何区分药物颗粒、蛋白聚集、外来异物给不溶性微粒/可见异物检测带来了挑战。随着检测技术的发展，AI智能算法等先进的检测技术可以更好的对不溶性的来源进行分类和整理，为快速鉴别颗粒，加快生物产品的研发提供了助力。
参考文献：
1. Roesch A, Zölls S, Stadler D, Helbig C, Wuchner K, Kersten G, Hawe A, Jiskoot W, Menzen T. Particles in Biopharmaceutical Formulations, Part 2: An Update on Analytical Techniques and Applications for Therapeutic Proteins, Viruses, Vaccines and Cells. J Pharm Sci. 2022 Apr;111(4):933-950.
2. Messick, Steven R, Miguel Saggu and Anacelia Ríos Quiroz. “Chapter 11: Particles in Biopharmaceuticals: Causes, Characterization, and Strategy.” (2020).
3. Gross-Rother J, Blech M, Preis E, Bakowsky U, Garidel P. Particle Detection and Characterization for Biopharmaceutical Applications: Current Principles of Established and Alternative Techniques. Pharmaceutics. 2020 Nov 19;12(11):1112.
