摘 要： 建立气相色谱-质谱法测定替格瑞洛中间体［4，6-二氯-2-（丙硫基）-5-氨基嘧啶（DCPA）］中潜在基因毒性杂质1-溴丙烷。样品以N，N-二甲基甲酰胺溶解后直接进样，经Agilent DB-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）分离，采用选择离子扫描（SIM）模式定量分析。1-溴丙烷的质量浓度在131.8～1 758 ng/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数为0.999 8，检出限为0.40 μg/g，定量限为1.32 μg/g。样品加标平均回收率为91.8%，测定结果的相对标准偏差为2.9%（n=6）。该方法简单便捷、专属性强、灵敏度高，可为卤代烃类基因毒性杂质的痕量检测提供方法参考。

 

关键词： 替格瑞洛； 基因毒性杂质； 1-溴丙烷； 气相色谱-质谱法； 卤代烃

 

 

替格瑞洛为环戊基三唑嘧啶类药物，可作用于P2Y12受体，减少二磷酸腺苷(ADP)结合位点[1]，进而抑制ADP介导的血小板聚集，是一种新型的血小板聚集抑制剂，为急性冠脉综合征(ACS)首选药物[2‒3]。4，6-二氯-2-(丙硫基)-5-氨基嘧啶(DCPA)为替格瑞洛制备的关键中间体[4]，DCPA结构中丙硫基的形成涉及1-溴丙烷的亲核取代，制备过程存在1-溴丙烷残留风险(图1)。

图1   替格瑞洛合成示意图

Fig. 1   Synthetic schematic diagram of Ticagrelor

基因毒性杂质是一类能直接或间接损伤细胞DNA，产生基因突变，诱导细胞癌变的化合物[5‒6]。对于化合物基因毒性的风险评估，首先需要关注其是否具有警示结构，卤代烷烃具有强的反应活性，可与DNA碱基发生亲电反应，属于警示性功能基团[7‒8]。随着药物分析技术以及对基因毒性杂质认识的不断发展，相关监管指南正逐步建立和完善，为消除临床隐患，提升用药安全性，有必要对DCPA中残留的潜在基因毒性杂质溴丙烷进行测定和控制，以降低其在替格瑞洛中的残留风险。

目前对溴丙烷的分析主要集中在职业卫生领域，研究对象涉及尿液、血液等生物样本以及场所环境等，检测方法包括气相色谱(GC)法、顶空气相色谱(HS-GC)法、气相色谱-质谱(GC-MS)法和顶空气相色谱-质谱(HS-GC-MS)法[9‒12]，而医药领域鲜有相关报道，王静文等[13]建立了顶空气相色谱法测定盐酸罗哌卡因原料药中残留的溴丙烷溶剂。有别于一般杂质，基因毒性杂质通常为痕量杂质，限度要求低，同时基因毒性杂质常含有活泼基团，稳定性较差[14]，此外，药品复杂的成分也会对基因毒性杂质的检测造成干扰[15]，因此，对于潜在基因毒性杂质1-溴丙烷而言，其分析方法的开发、验证以及限度的制定均有待进行针对性地研究。笔者建立了GC-MS法测定DCPA中潜在基因毒性杂质1-溴丙烷，并进行了方法学研究，可为替格瑞洛的质量控制提供参考和依据。

 

1、 实验部分

 

 

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱-质谱联用仪：7890B-5977A型，美国安捷伦科技有限公司。

超声波发生仪：S100H型，德国艾尔玛公司。

电子分析天平：BSA224S型，感量为0.1 mg，德国赛多利斯公司。

甲醇、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1-溴丙烷标准品：纯度(质量分数)为99.5%，上海安谱实验科技股份有限公司。

DCPA样品：纯度(质量分数)为99%，批号011005，上海汇伦医药股份有限公司。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，美国安捷伦科技有限公司)；载气：高纯氦气，流量为1.0 mL/min；进样口温度：250 ℃；升温程序：起始温度40 ℃，维持5 min，以60 ℃/min的速率升温至280 ℃，维持11 min；进样体积：1.0 μL；分流比：5∶1。

1.2.2 质谱条件

离子源：电子轰击离子源(EI)；电离能：70 eV；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；传输线温度：280 ℃。扫描方式：全扫描(SCAN)模式定性，选择离子扫描(SIM)模式定量，定量离子(m/z)122；1-溴丙烷的出峰时间：2.250 min。

1.3 实验步骤

1.3.1 溶液配制

1-溴丙烷标准品溶液：精密称取1-溴丙烷标准品约40 mg，置于100 mL容量瓶中，用DMF溶解并稀释至标线，摇匀。精密量取上述1-溴丙烷溶液0.5 mL于250 mL容量瓶，用DMF稀释至标线，摇匀，配制成质量浓度约为800 ng/mL的1-溴丙烷标准品溶液。

1-溴丙烷标准储备液：取1-溴丙烷标准品适量，以DMF溶解并稀释制成质量浓度为8.791 μg/mL的1-溴丙烷标准储备液。

1-溴丙烷系列标准工作溶液：精密量取1-溴丙烷标准储备液适量，以DMF分别稀释制成质量浓度为131.8、263.7、439.6、879.1、1 319、1 758 ng/mL的系列标准工作溶液。

加标样品溶液：分别取DCPA样品和1-溴丙烷标准储备液适量，以DMF超声溶解并稀释，制成DCPA的质量浓度为100 mg/mL、1-溴丙烷的质量浓度为879.1 ng/mL的加标样品溶液。

样品溶液：精密称取DCPA样品约1 g，置于10 mL容量瓶中，加入DMF超声溶解并稀释至标线，摇匀。

1.3.2 测定方法

在1.2仪器工作条件下，测定1-溴丙烷系列标准工作溶液，以1-溴丙烷质量浓度为横坐标，以1-溴丙烷监测离子的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用外标法定量。

 

 

2、 结果与讨论

 

 

2.1 溶剂选择

对于1-溴丙烷的检测而言，尿液样本通常以纯化水为溶剂，血液样本以甲醇为溶剂，纺织品以丙酮为提取剂和溶剂。1-溴丙烷和DCPA均不溶于水，甲醇、丙酮虽然溶解性较好，但是其色谱峰与1-溴丙烷色谱峰发生部分重叠，产生溶剂效应，影响方法的专属性和灵敏度。为了避免溶剂干扰，选择具有较高沸点且对DCPA和1-溴丙烷均具有较好溶解性的DMF为溶剂。

2.2 色谱条件选择

基于1-溴丙烷较好的热稳定性和易气化的特性，采用简单便捷的直接进样方式进样，同时，为了兼顾色谱峰形的改善和灵敏度的提高，采用分流进样模式，分流比设置为5∶1。

分别比对了HP-5MS柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)和DB-624柱(30 m×0.25 mm，1.4 μm)两种不同极性的色谱柱。结果表明，两种色谱柱均能较好地分离1-溴丙烷，但在HP-5MS柱上的保留时间明显小于DB-624柱，这与HP-5MS色谱柱较弱的极性和较小的膜厚有关。此外，为了避免直接进样时样品中残留基质对测定结果的干扰，提高色谱柱的稳定性，通常需采用较高的柱温，然而，鉴于DB-624柱较厚的膜层，其最高工作温度仅为260 ℃，相反，HP-5MS柱拥有极低的柱流失，最高工作温度为325 ℃。综合考虑，选用HP-5MS柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)作为分析柱。

2.3 监测离子的选择

在1.2.2质谱条件下，对1-溴丙烷标准储备液进行全扫描测定(质量数范围35～140 Da)，结果如图2所示。

图2   1-溴丙烷质谱图

Fig. 2   Mass spectrum of 1-bromopropane

由图2可以看出，在70 eV电压下，1-溴丙烷主要呈现43、122、124三个质谱峰，分别对应于丙烷正离子、分子离子峰及相应溴的同位素峰。鉴于丙酮、乙酸乙酯等常用溶剂均含有特征离子峰43，为了避免溶剂干扰，同时兼顾检测灵敏度，选择122为定量离子。

2.4 杂质限度的确定

1-溴丙烷含卤代烃警示结构，为潜在基因毒性杂质，需作为基因毒性杂质来控制。研究表明，1-溴丙烷主要表现为神经毒性和生殖毒性[11,16]，缺少致突变性、致癌性等毒理学试验数据，为ICH M7 (R2)(国际人用药品注册技术协调会指导原则)指南中第3类基因毒性杂质，可采用毒理学关注阈值(TTC，1.5 μg/d)作为可接受摄入量，结合替格瑞洛的日最大用药剂量180 mg，计算确定1-溴丙烷的限度为8 μg/g。

2.5 专属性试验

在1.2仪器工作条件，分别取空白DMF溶液、1-溴丙烷标准品溶液以及加标样品溶液进样检测，结果如图3所示。

 

图3   DMF溶液、1-溴丙烷标准品溶液和加标样品溶液色谱图

Fig. 3   Chromatograms of DMF solution，1-bromopropane standard solution and spiked sample solution

 

由图3可以看出，空白溶液和样品溶液对1-溴丙烷的测定没有干扰，标准品溶液和加标样品溶液中的1-溴丙烷保留时间一致，表明方法具有良好的专属性。

2.6 线性方程和检出限

在1.2仪器工作条件，分别测定1-溴丙烷系列标准工作溶液，以1-溴丙烷质量浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线，拟合后的线性方程为y=57.023x+366.61，相关系数为0.999 8，表明1-溴丙烷的质量浓度在131.8～1 758 ng/mL范围内与色谱峰面积具有良好的线性关系。

取适量1-溴丙烷标准品，用DMF溶解稀释，配制成质量浓度分别为39.56、131.8 ng/mL的溶液作为检出限和定量限溶液，以3倍信噪比对应的1-溴丙烷质量浓度作为检出限，以10倍信噪比对应的1-溴丙烷质量浓度作为定量限。根据样品质量和定容体积换算为样品中的含量，以质量分数表示，得方法检出限为0.40 μg/g (相当于限度浓度的5%)，定量限为1.32 μg/g (相当于限度浓度的16.5%)。方法的检出限和定量限均小于限度要求，能够满足测定要求。

2.7 精密度试验

取DCPA样品适量，按1.3.1方法平行配制6份样品溶液并测定，结果见表1。由表1可知，6次测定结果的相对标准偏差为2.9%，表明建立的方法具有良好的精密度。

表1   精密度试验结果

Tab. 1   Precision test results

 

 

2.8 加标回收试验

按1.3.1方法配制DCPA样品溶液，配制过程中，精密加入适量1-溴丙烷标准储备液，使溶液中待测1-溴丙烷的质量浓度分别为476、827、1 179 ng/mL，分别相当于50%、100%、150%的限度水平，测定结果见表2。由表2可知，1-溴丙烷的平均回收率为91.8%，表明该方法具有良好的准确度。

表2   加标回收试验结果

Tab. 2   Test results of standard addition recovery

 

 

2.9 溶液稳定性试验

取1-溴丙烷标准品溶液于室温下放置，分别于

第0、1、2、16 h四个时间点取样测定，结果见表3。由表3可知，1-溴丙烷色谱峰面积测定结果的相对标准偏差为1.4%，表明1-溴丙烷溶液在16 h内具有良好的稳定性。

表3   1-溴丙烷溶液稳定性试验结果

Tab. 3   Stability test results of 1-bromopropane solution

 

3、 结语

 

 

建立了GC-MS法测定替格瑞洛关键中间体DCPA中潜在基因毒性杂质1-溴丙烷的方法，并进行了方法学验证。该方法简单便捷、专属性强、灵敏度高，适用于DCPA中1-溴丙烷的检测与控制，以降低其在终产品替格瑞洛中的残留风险，提升质量可控性。此外，方法的建立也可为其他药物或中间体中卤代烃类基因毒性杂质的痕量检测提供参考。

 

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