常见荧光定量PCR方法比较

SYBR Green I 检测模式

SYBR Green I 是一种能与双链 DNA 结合发光的荧光染料。其与双链 DNA 结合后， 荧光大大增强。因此， SYBR Green I 的荧光信号强度与双链 DNA 的数量相关，可以根据荧光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量。SYBR Green I 的最大吸收波长约为 497nm，发射波长最大约为 520nm。PCR 扩增程序一般为 94℃～55℃～72℃三步法，40 个循环。SYBR Green I 的缺点：由于 SYBR Green I 没有特异性，不能识别特定的双链，只要是双链就会结合发光，对 PCR 反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，所以在临床上使用可能会有假阳性发生。

SYBR Green I 的优点：SYBR Green I 的优点是因为其缺点产生，由于它能所有的双链DNA相结合，所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针，通用性较好，并且价格相对较低。这对科研是很有利的，因此国内外在科研中使用比较普遍。

SYBR GREEN I work principle

水解探针模式(Taqman探针)

TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的 5’末端， 而淬灭剂则在 3’末端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3’端的淬灭剂接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的 5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此 Taqman 探针检测的是积累荧光。PCR 扩增程序通常是：94℃～60 ℃ 40 个循环。常用的荧光基团是 FAM，TET，VIC，HEX。

Taqman work principle

杂交探针模式(Beacon、FRET)

分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。分子信标的茎环结构中，环一般为 15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补;茎一般 5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂则标记在另一端。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。由于是酶切作用的存在，分子信标也是积累荧光。常用的荧光基团：FAM ，Texas Red 。PCR 扩增程序通常是：94～55～72 ℃三步法，40 个循环。

分子信标工作原理

FRET 探针又称双杂交探针，FRET 探针由两条相邻探针组成，在一条探针的 5`端标记 FAM 荧光基团，另一探针的 3`端标记 Red 640 荧光基团。当复性时，探针结合在模板上，FAM 基团和 Red640 基团相邻，激发 FAM 产生的荧光，作为 Red640 基团的激发光被吸收，使 Red640发出波长为 640 的荧光。当变性时，探针游离，两基团距离远，不能产生 640 波长的荧光。由于 FRET 探针是靠近发光，所以检测信号是实时信号，非累积信号。常用的荧光基团是：LC-Red640，LC-Red705。

能用于实时荧光 PCR 定量的方法很多，各有优缺点，应根据实验的需要和当前的实验条件选择适合自己的方法。下面为各种方法的比较：