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嘉峪检测网 2022-01-19 14:30
有关物质的药物质量研究中的重点内容，多以HPLC法作为有关物质检查的方法，基于杂质的限度较低，一般有关物质检查需要较高的供试品浓度，但是当药物的规格低，原液的浓度低时，以常规的有关物质方法开发思路设计实验无法满足测定的需求。本文结合工作中的案例对小规格药物的有关物质HPLC法开发进行分享。
案例一：
直接信息1：注射液用载药脂肪乳A的规格为8μg；
直接信息2：工艺中每瓶为4μg/ml的药液2ml冻干得到；
直接信息3：临床上注射液用载药脂肪乳A4μg或8μg用10ml的生理盐水稀释后静脉注射， 1次/日；
间接信息4：制剂中控制的已知杂质包括杂质Ⅰ（限度1.0%）、杂质Ⅱ（限度1.0%）、其他未知最大单杂为1.0%、总杂为1.0%；
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参数 |
方法1 |
方法2 |
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色谱柱 |
C18 |
C18 |
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流动相 |
乙腈-缓冲盐，梯度洗脱 |
乙腈-缓冲盐，梯度洗脱 |
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柱温 |
30℃ |
30℃ |
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检测波长 |
254nm |
254nm |
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流速 |
1.0ml/min |
1.0ml/min |
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进样量 |
20μl |
80μl |
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供试品可制备的最大浓度 |
8μg/ml |
8μg/ml |
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定量限浓度 |
响应最低的杂质Ⅰ为0.019μg/ml（S/N约15） |
响应最低的杂质Ⅰ为0.08μg/ml（S/N约13） |
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方法的定量限水平 |
0.2% |
0.1% |
案例分析：方法1到方法2的变更参数仅为进样量，在方法1条件下各杂质色谱峰的对称性均良好，因此，可以认为当前色谱条件为最佳，然而在此方法下的定量限高于报告阈值，考虑通过浓缩富集提高供试品浓度或提高进样量的方式进行方法优化，结果通过方法2提高进样量后，达到了预期的测定要求。
值得注意的是本案例中的供试品样品的制备，取10瓶供试品，用少量水溶解转移至10ml量瓶中，定容，摇匀制备得到。
案例二：
直接信息1：某液体制剂B规格为0.5ml：0.1μg；
直接信息2：处方成分包括硼酸、HPMC、氯化钠、EDTA、盐酸；
直接信息3：临床最大日用量0.1μg；
直接信息4：B原料水中微溶、甲醇中易溶；
间接信息5：制剂中控制的已知杂质包括杂质Ⅰ（限度1.0%）、其他未知最大单杂为1.0%、总杂为1.0%；
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参数 |
方法1 |
方法2 |
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色谱柱 |
C18 |
C18 |
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流动相 |
甲醇-缓冲盐，梯度洗脱 |
甲醇-缓冲盐，梯度洗脱 |
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柱温 |
35℃ |
35℃ |
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检测波长 |
220nm |
220nm |
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流速 |
1.0ml/min |
1.0ml/min |
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进样量 |
20μl |
20μl |
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供试品浓度 |
0.2μg/ml |
4μg/ml |
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供试品制备方法 |
取10支供试品混匀即得 |
取8支供试品混匀后，上样于活化后的SPE小柱中，用水及适宜溶剂将辅料洗脱后，用甲醇将主成分B洗脱，氮气吹干后，用200μl溶剂复溶，即得 |
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定量限浓度 |
响应最低的主成分B为0.004μg/ml（S/N约12） |
响应最低的主成分B为0.004μg/ml（S/N约13） |
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方法的定量限水平 |
2% |
0.1% |
案例分析：方法1到方法2的变更参数仅为供试品制备方法，前提为方法1条件下各杂质色谱峰峰形对称，理论板数较高，各杂质峰分离良好，为当前最佳色谱条件，然而方法1的定量限高于报告阈值20倍，考虑通过浓缩富集提高供试品浓度的方式进行方法优化，结果通过方法2应用SPE小柱进行供试品浓缩富集后，达到了预期的测定要求。
值得注意的是本案例中SPE的供试品制备过程中，需要添加内标物，保证制备的回收率与测定结果的准确性。
案例三：
直接信息1：某液体制剂C规格为1ml：1μg；
直接信息2：临床最大日用量20μg；
直接信息3：C原料水中微溶、乙腈中易溶；对热较为稳定；
间接信息4：制剂中控制的最大单杂为1.0%、总杂为1.0%；
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参数 |
方法1 |
方法2 |
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色谱柱 |
C18 |
C18 |
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流动相 |
甲醇-乙腈-缓冲盐，梯度洗脱 |
甲醇-乙腈-缓冲盐，梯度洗脱 |
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柱温 |
35℃ |
35℃ |
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检测波长 |
210nm |
210nm |
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流速 |
1.0ml/min |
1.0ml/min |
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进样量 |
20μl |
20μl |
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供试品浓度 |
1μg/ml |
0.1mg/ml |
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供试品制备方法 |
取5支供试品混匀即得 |
取50支供试品减压旋干后，用0.5ml乙腈复溶后，离心，取上清，即得 |
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定量限浓度 |
响应最低的主成分C为0.1μg/ml（S/N约14） |
响应最低的主成分C为0.1μg/ml（S/N约12） |
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方法的定量限水平 |
10% |
0.1% |
案例分析：方法1到方法2的变更参数仅为供试品制备方法，方法1为当前色谱最佳条件，但定量限高于报告阈值100倍，考虑通过浓缩富集提高供试品浓度的方式进行方法优化，结果通过方法2应用减压富集供试品浓度后，达到了预期的测定要求。
值得注意的是本案例中减压富集供试品制备过程中，需要添加内标物，保证制备的回收率与测定结果的准确性。
案例四：
直接信息1：某液体制剂D规格为2ml：20μg；
直接信息2：临床最大日用量20μg；
直接信息3：已知杂质包括杂质Ⅰ在紫外区吸收较弱；
间接信息4：制剂中控制的已知杂质包括杂质Ⅰ（限度1.0%）、最大单杂为1.0%、总杂为1.0%；
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参数 |
方法1 |
方法2 |
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色谱柱 |
C18 |
C18 |
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流动相 |
甲醇-乙腈-缓冲盐，梯度洗脱 |
甲醇-乙腈-缓冲盐，梯度洗脱 |
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柱温 |
35℃ |
35℃ |
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检测波长 |
205nm |
280nm |
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流速 |
1.0ml/min |
1.0ml/min |
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进样量 |
20μl |
20μl |
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供试品浓度 |
10μg/ml |
10μg/ml |
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提高灵敏度措施 |
— |
采用合适的试剂以柱后衍生的方法将杂质Ⅰ转化为紫外吸收很强的结构 |
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定量限浓度 |
响应最低的杂质Ⅰ为2μg/ml（S/N约15） |
响应最低的杂质Ⅰ为0.01μg/ml（S/N约14） |
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方法的定量限水平 |
50% |
0.1% |
案例分析：方法1到方法2的变更参数为检测波长和检测过程中的柱后衍生，方法1为当前色谱最佳条件，但定量限高于报告阈值500倍，样品规格较小以SPE和减压旋干的方式富集500倍较为困难，因此，考虑衍生化的方法提高检测的灵敏度，达到检测要求。
综上所述，对小规格药物的有关物质HPLC法开发中，需把握几个关键点：检测器选择、供试品制备、进样量，当然以上关键点是在色谱条件较优的前提下，即色谱峰对称性、理论板数、分离度等系统适用性良好，可通过提高进样量、供试品富集制备、衍生化的方式达到有关物质的测定要求，对药物的有关物质进行专属、准确和灵敏的测定。
来源：药事纵横
