摘 要Abstract
近年来，随着技术的不断发展和研究的不断深入，溶瘤病毒产品对肿瘤细胞的选择性和有效性不断提高，对正常细胞的影响进一步降低，产品的安全性稳步提升，逐步成为国内外研发热点。为鼓励和促进溶瘤病毒产品的发展，国家药品监督管理局药品审评中心于2023 年2 月13 日正式发布了《溶瘤病毒产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》。本文结合指导原则制定背景，对指导原则内容和重点问题进行详细解读，以供业界更好的理解和运用指导原则技术要求，进一步促进国内溶瘤病毒产品研发和申报规范性。
In recent years, with the continuous development of technology and research, the selectivity and effectiveness of oncolytic virus products in targeting tumor cells have been improving, while their impact on normal cells has been reduced.The safety of these products has steadily increased, making them a research and development hotspot around the world. To encourage and facilitate the development of oncolytic virus products, the Center for Drug Evaluation of the National Medical Products Administration officially issued the Guidance on CMC Study and Evaluation Techniques of Oncolytic Virus Products (Trial) on February 13, 2023. This paper provides a detailed interpretation of the main content and some important issues of the guidance, combined with the drafting background, aiming to provide the industry with a better understanding and application of the technical requirements specified in the guidance and promote the standardization of oncolytic virus products development and application in China.
关键词Key words：
溶瘤病毒产品；药学研究；解读
oncolytic virus products; CMC research; interpretation
近年来，溶瘤病毒作为肿瘤免疫治疗的一类产品在临床上得到应用，也取得了一定的临床进展。截至2023 年5 月， 全球已批准4 款溶瘤病毒产品上市：2004 年，Latima 公司开发的ECHO-7（ 商品名：Rigvir） 在拉脱维亚获得批准， 用于治疗黑色素瘤[1] ；2005 年， 上海三维生物公司开发的H101（商品名：安柯瑞）在中国获得批准，用于治疗鼻咽癌和头颈部癌[2-3] ；2015 年，Amgen 公司开发的T-VEC（ 商品名：Imlygic） 在美国获得批准，用于治疗黑色素瘤，随后该产品在欧盟也获得批准[4] ；2022 年， 第一三共株式会社（Daiichi Sankyo）开发的G47Δ（商品名：Delytact）在日本获得批准，用于治疗恶性胶质瘤[5]。同时，近年来我国批准的用于各类恶性肿瘤临床试验的溶瘤病毒产品数量也迅速增加，主要病毒类型包括腺病毒、呼肠孤病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒等。为规范溶瘤病毒产品的研发和申报，国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）于2023 年2 月13 日正式发布了《溶瘤病毒产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》（以下简称：指导原则）。本文旨在结合溶瘤病毒产品的特点，对指导原则制定背景、内容和需要关注的重点问题进行介绍，以便业界更好地理解和应用该指导原则。
1、指导原则制定背景
1.1 制定目的
本指导原则是根据国家颁布的相关法律法规要求，参考国外相关指导原则，结合国内溶瘤病毒产品的研发现状，以《中国药典》（2020 年版）“人用基因治疗制品总论”和《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》为基础制定的。
溶瘤病毒产品和体内基因治疗产品在产品设计和质量研究上有一定相似性，但两者之间也存在一定差异，如适用的病毒类型不同、病毒复制特性不同、作用机制不同。体内基因治疗产品一般是非复制型病毒，如腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒等[6]，而溶瘤病毒产品一般是具有复制能力的病毒，如痘苗病毒、腺病毒、呼肠孤病毒、单纯疱疹病毒等。另外，体内基因治疗产品的作用机制一般是通过对人体细胞的遗传物质进行修饰、表达外源基因、操纵细胞基因表达或调控细胞生物学活性等达到治疗疾病目的[6]，而溶瘤病毒产品通常是通过直接裂解肿瘤细胞、表达外源基因、刺激机体产生免疫反应等达到治疗疾病的目的，因而有必要针对溶瘤病毒产品制定药学指导原则。指导原则的试行一方面为行业研发和申报提供技术支撑，另一方面也为监管机构统一审评尺度提供依据。
1.2 起草思路
指导原则整体思路涵盖了以下几点考虑。
指导原则重点围绕溶瘤病毒产品药学研究中的生产用物料、生产工艺、质量研究、外源病毒因子控制、稳定性研究和包装系统等方面提出技术要求。技术要求涵盖了特殊性问题考虑，如不同类型生产/ 包装细胞系的风险层级和基本要求，不同用途质粒DNA 的技术要求等。技术要求也涵盖了共性问题考虑，比如外源病毒因子控制策略、分子变体的检测和控制等。
指导原则提出的是科学性建议，并非强制要求，希望申请人在开展产品研究时根据具体品种的适用性，具体问题具体分析，并加强与监管机构的沟通和交流。
指导原则中的建议和要求仅反映了现阶段对溶瘤病毒产品的认识和一般性考虑，随着技术和理念的进步，申请人可以考虑采用其他更适宜或更优的策略和方法，CDE 也会随着行业发展和认知深入，适时对指导原则进行修订。
2、指导原则介绍
指导原则共包括12 个部分，前10 个部分为指导原则主要内容，其中前言、适用范围、一般原则、风险评估与控制属于总括性章节，生产用物料、生产工艺、质量研究与质量标准、外源病毒因子检测和控制、稳定性研究、包装及密封容器系统等是按照产品研发的几个重要方面进行论述。考虑到这类产品溶瘤病毒外源病毒因子控制的特殊性，在第八章“外源病毒因子检测和控制”中进行了全面的论述，下文将对外源病毒因子检测和控制策略重点解读。
另外，指导原则结合目前溶瘤病毒的类型，尽可能在相应章节针对不同类型病毒把当前的审评考虑进行了说明。以下将对指导原则中部分重点内容及相关考虑予以说明，以进一步提高业界同仁的理解和认识。
2.1 一般原则
溶瘤病毒产品作为药品开发，应遵守药品研发相关法律法规和规范性文件，同时还需要遵循药品研发的一般规律。溶瘤病毒产品活性成分和作用机制特殊，因此在基因设计、生产工艺、质量研究和控制、贮存和运输以及临床使用等各个阶段均应建立基于产品特点的风险控制策略。另外，其为一类具有复制能力的“活病毒”，因此需要特别关注产品研发、生产、使用和废弃处理过程中的生物安全性风险。
观察溶瘤病毒产品的全球研发现状，处在临床试验阶段的产品较多，批准上市的产品较少，行业对于临床试验阶段的药学技术要求有较大的迫切性。在此背景下，指导原则在一般原则章节中针对溶瘤病毒不同研发阶段的考虑进行了重点说明，包括临床试验阶段、临床试验期间、上市申报阶段的技术要求。例如，在临床试验阶段，重点关注与产品安全性相关的问题，确保临床试验用产品的安全性。申报临床阶段用于非临床研究用产品的质量对产品进行后续开发提供重要依据，临床试验用产品的质量应不劣于非临床研究用产品质量。另外，病毒本身的安全性、生产用物料的控制等对确保产品安全也非常重要，虽然在该内容项下未详细阐述技术要求，但可以参考第五章“生产用物料”中的基本要求。同时，为了初步证明生产工艺的可行性及稳健性，还需对临床试验用产品生产工艺进行初步确认，建立初步的中间体控制项目和标准。质量研究方面需进行必要的方法确认，建立适用于临床的质量标准，保证临床样品的质量。产品的稳定性研究结果应能支持样品开展临床试验。在包装及密封容器方面，应有相应数据以证明其适用性。
2.2 风险评估与控制
该章节按照此类产品的特点对主要风险进行了列举，并提出了相应的质量控制策略。需要关注的是溶瘤病毒产品类型较多，基因设计、生物学特性和作用机制复杂，使用到的生产/ 包装细胞类型多样，生产工艺和质量研究也各有不同，因此指导原则所列举的风险因素未必包含了产品所有的风险因素，同时指导原则列举的风险因素也未必在所有产品中均存在。指导原则通过列举这些风险因素，希望申请人在开展产品研究时，充分结合自身产品特点建立风险控制理念，并且制定相应的控制策略，以确保临床试验用样品的安全性和有效性。
2.3 生产用物料
该章节针对不同类型生产用物料提出相应技术要求。生产用物料包括用于生产溶瘤病毒产品的物质或材料，包括起始原材料（如病毒种子、生产/ 包装细胞）；生产过程中使用或添加的原材料（如培养基及其添加成分、纯化试剂等）、辅料、以及生产用耗材（如培养袋、储液袋、移液管路、滤膜等）等。
病毒种子作为产品中重要的起始原材料，应根据初始病毒来源不同开展相应的研究，还应根据基因修饰类型不同关注其潜在风险并开展相应研究。同时，病毒种子的筛选、建立、检定及传代稳定性研究均应结合具体产品具体分析，并开展相应研究。目前常用于溶瘤病毒产品开发的病毒来源包括野生型病毒、减毒病毒和基因修饰病毒。除野生型病毒产品以外，其他2 种类型的病毒产品可能在传代和（或）生产过程中通过回复突变或同源 / 非同源重组形成亲本基因型病毒或野生型病毒，这种形式的病毒通常称为初始病毒（或野生型病毒），下文在“重点问题说明”中将对初始病毒（或野生型病毒）的具体含义和技术要求重点说明。
通常情况下，溶瘤病毒产品中用于制备病毒种子的质粒DNA是一次性使用的，但指导原则的制定应兼顾包容性和全面性，因此也纳入了需要建立细菌种子批生产质粒DNA 的技术要求。希望申请人在开展产品研究时可以结合自身产品特点开展相关研究。
生产/ 包装细胞作为建立病毒种子或者生产溶瘤病毒产品的关键起始原材料需要开展研究和控制。通常情况下，无论是用于包装病毒以获得病毒种子的细胞基质，还是生产溶瘤病毒的细胞基质，均应满足来源清晰、历史培养过程清楚、风险可控及全面检定的要求。
2.4 生产工艺
该章节对溶瘤病毒产品的生产工艺开发、工艺过程控制以及工艺验证研究进行了介绍。
工艺开发过程中常伴随工艺优化和调整，因此需要开展可比性研究，可比性研究策略需要根据变更发生的阶段、变更的类型、变更的影响来综合分析变更的风险，从而确定可比性研究内容、研究批次数量、可接受标准，以及是否需要开展非临床和临床桥接研究。
2.5 质量研究与质量标准
产品研发过程中需对产品质量进行系统、深入的研究，制定科学、合理、可行的质量标准，并不断地修订和完善，以控制产品质量，确保其在有效期内安全有效。
该章节分别从鉴别和结构分析、生物学活性、含量、纯度、杂质、污染物以及其他特性等方面对此类产品的主要研究项目进行了列举，并针对相对较成熟的分析方法进行了说明，但所列举的项目和分析方法并不一定适用于所有产品，具体的研究项目和分析方法还需要结合具体品种特点研究确定。
例如，产品纯度研究方面，由于病毒类型不同，结构复杂，很难采用一种准确的分析方法对纯度进行衡量，因而多数情况下产品的纯度需要结合病毒特点、生产特点等控制多种质量项目综合评估产品纯度。生物学活性方面，由于不同产品设计不同，作用机制也存在差异，通常情况下采用体外细胞法检测溶瘤病毒产品对易感肿瘤细胞的毒性/ 裂解作用和（或）其在细胞中的复制能力是衡量产品对肿瘤细胞选择性的重要指标，但在某些情况下，选择的肿瘤细胞系/ 株与动物/ 人体肿瘤细胞原代培养物之间可能存在一定差异，所以在选择体外细胞系/ 株需要考虑是否具有代表性。体外实验可能并不能完全反映溶瘤病毒产品的体内效应，有些情况下，需要考虑采用动物体内检测法对体外生物学活性检测方法进行确认。对于一些溶瘤病毒产品在设计时通常会插入一些特定基因，以提高其相应的生物学功能，这种情况下还需要对转基因表达水平和生物学特性进行定量和定性分析，并作为生物学活性的一个指标。
质量标准一般根据产品的质量研究确定，质量研究中需要确定关键质量属性，一般情况下，关键质量属性应纳入质量标准。本章节中从检验项目、标准限度和分析方法3 个方面对质量标准的主要技术要求进行说明，目前指导原则中并未规定具体的检测项目和验收标准，是考虑到病毒类型复杂多样，生产工艺也各有不同，希望申请人根据自身产品特点、生产工艺和质量研究情况，建立科学合理的质量标准。
2.6 外源病毒因子的检测和控制
溶瘤病毒产品的病毒污染可能来源于细胞库，动物/ 人源性材料、生产过程的偶然引入等，因此对溶瘤病毒进行外源病毒的检测和控制非常重要。
溶瘤病毒产品本身是一种“活病毒”，采用传统的检测方法（如培养法）区分“溶瘤病毒”和“外源病毒”存在一定困难。另外，采用中和抗体法中和后进行检测也存在一定困难，一是某些病毒很难筛选到可以有效中和“溶瘤病毒”的中和抗体；二是使用大量抗体进行中和可能会稀释检测样本从而导致假阴性结果；三是证明筛选的中和抗体不会中和“外源病毒”需要测试足够种类的阳性病毒，对测试方法提出了挑战。为更好地控制这类产品被外源病毒污染的风险，应该充分结合这类产品特点、工艺特点制定多阶段的控制策略，具体可从以下几个方面考虑。
首先，细胞库、病毒种子批和工艺中使用的动物/ 人源性材料均具有引入外源病毒污染的风险，因此在使用这些物料前需进行外源病毒的全面检测。细胞库的外源病毒因子检测可参考《中国药典》（2020 年版）和人用药品技术要求国际协调理事会（ICH）指南Q5D 相关要求，结合细胞来源、传代或改造历史、建库过程中使用原材料情况等进行风险评估后确定[7-8]。病毒种子批的外源病毒因子检测可通过加入中和抗体或设置对照细胞进行检测，也可考虑增加聚合酶链反应（PCR）、深度基因测序技术等敏感检测技术排除特异性的外源病毒因子污染的风险[7]。生产过程中使用的动物/ 人源材料应结合原材料来源进行特异性病毒检测，还需要加强这类原材料的供应商审计，建立规范的质量管理体系，并结合供应商检测标准和风险评估建立企业内控标准。
其次，生产过程中可能存在引入外源病毒的风险，以及在生产用物料阶段某些外源病毒可能未被检测到，因而需要在生产过程中选择适宜阶段的工艺中间体进行检测，工艺中间体外源病毒的检测方法同病毒种子批。
最后，考虑到任何病毒检测方法都可能会受到定量方法本身的限制，以及不同类型病毒的生产工艺不同，因而除在生产用物料和生产过程中开展外源病毒因子的检测和控制外，还需结合具体产品的情况，根据研究与验证结果增加必要的病毒去除/ 灭活步骤、终产品中特异性病毒检测等，但是这两个阶段的控制并不是一个强制要求，也不是对所有产品都适用，需要具体问题具体分析。
3、 重点问题说明和解读
3.1 初始病毒（或野生型病毒）的具体含义
目前常见的溶瘤病毒产品包含三种类型：一是天然的具有一定肿瘤选择性的野生型病毒，二是对肿瘤细胞具有一定选择性的减毒病毒，其可通过减毒操作获得，也可通过自然发生（即非基因修饰）筛选获得；三是将特定类型的病毒，采用分子克隆、基因合成等技术进行基因修饰后获得的重组病毒。其中基因修饰的重组病毒作为一类比较常见的溶瘤病毒产品被广泛应用到临床，在构建重组病毒前需要采用来源清晰的起始病毒进行基因修饰，起始病毒来源较为广泛，一般包括野生型病毒、经过减毒或适应的病毒、已经过基因修饰技术改造的病毒等，在本指导原则中统称为“初始病毒”。由于重组病毒在传代和（或）生产过程中可能通过回复突变或同源 / 非同源重组形成“初始病毒”，而这些“初始病毒”可能会对产品的安全性和有效性产生影响，因此需要在病毒种子批检定、传代稳定性和质量研究中对“初始病毒”进行检测和控制。
在某些特定情况下， 例如当“ 初始病毒” 来源于野生型病毒， 那么在传代和（ 或） 生产过程中回复突变或同源/ 非同源重组形成的病毒也可以称为野生型病毒。美国食品药品监督管理局（FDA） 在2020年发布的指导原则Chemistry，Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs) 中对类似概念的表述为 “Parental（or WT）genotype”[8]，本指导原则为了与美国FDA 指导原则的表述保持一致，采用了“初始病毒（或野生型病毒）”的表述。
3.2 生产/ 包装细胞成瘤性/ 致瘤性检测要求
目前溶瘤病毒产品开发中可能适用的生产/ 包装细胞类型较多，如正常细胞群连续传代建立的细胞系/ 株（如Vero）、肿瘤细胞系/ 株（如Hela、A549 等）、携带致瘤基因的传代细胞系/ 株（ 如HEK293） 等。不同类型细胞风险不同，在成瘤性/ 致瘤性检测方面的要求也有所不同。
首先，由于新型细胞基质和新建细胞株/ 系的成瘤性/ 致瘤性风险尚不完全清楚，建议参照《中国药典》（2020 年版）三部“ 生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”相关要求，进行成瘤性和（或）致瘤性检测，如果成瘤性检测为阳性，则需要进一步进行致瘤性检测，检测出致瘤性的细胞基质一般不建议使用。
其次，对于肿瘤细胞来源和携带致瘤基因的连续传代细胞系，其成瘤性或致瘤性风险较高。已知明确具有成瘤性的传代细胞，在细胞库检定中可不再要求开展成瘤性检测，但需要评估使用的必要性、合理性和安全性，同时建议开展致瘤性研究。
最后，对于正常细胞群连续传代建立的细胞系/ 株具有在体外连续传代的能力，理论上具有成瘤性和（或）致瘤性风险。某些传代细胞系已证明在一定代次内不具有成瘤性，而超过一定代次具有成瘤性（如Vero），因此需要对限传代次细胞进行成瘤性和（或）致瘤性检测。
3.3 分子变体的类型及技术要求
指导原则中分子变体指在病毒包装或生产过程中产生的非预期的变异体，可能包括某些基因序列和（或）氨基酸序列突变形成的变异体，也可能包括重组或回复突变形成的初始病毒（或野生型病毒）等。
不同类型的溶瘤病毒开展分子变体研究的方法可能不同。基因修饰的溶瘤病毒产品，病毒种子制备前通常会进行病毒的单克隆筛选，分子变体可能在病毒种子批制备和病毒生产过程中产生，可通过分子生物学方法（如PCR、限制性内切酶、基因测序、蛋白鉴别）等对分子变体进行研究和控制。野生型或减毒病毒，其本身可能包含不同的分子变体，采用基因测序方法可能无法检测到较低水平的分子变体，建议考虑采用其他检测方法以反映分子变体的数量和性质，重点关注可能改变病毒复制特性和溶瘤活性的分子变体。通常情况下，对病毒种子和生产限传代次病毒应进行全基因组分析，关注多次传代后病毒在基因序列和（或）氨基酸序列上的变化。可采用灵敏的、可量化的检测方法识别病毒全基因组中的所有突变，尤其关注改造区域或编码区域基因突变情况，充分评估突变对产品安全性和有效性的影响。另外，产品质量研究中，除采用PCR、限制性内切酶法对特征性序列进行鉴别外，还建议采用代表性生产工艺的若干批次进行全基因组测序，如在测序中发现基因序列或位点的突变，应对突变原因进行分析，开展分子变体对产品安全性和有效性影响的评估，也可基于文献报道和（或）根据其对蛋白质相互作用或功能潜在影响的模型进行评估。
3.4 产品相关杂质/ 物质的考虑
指导原则中产品相关杂质/物质主要类型可能包括分子变体、非完整包装病毒（如非包膜病毒颗粒、空壳病毒颗粒等）、错误包装病毒颗粒、无活性病毒颗粒、病毒颗粒聚集体等。
通常情况下，除目标产品以外的其他成分一般定义为产品相关杂质或工艺相关杂质，但是溶瘤病毒产品以外的其他成分可能无法简单定义为产品相关杂质，如病毒颗粒集聚体，通常与病毒表面的电荷有关，且病毒在较高浓度下容易形成聚集体，对于部分溶瘤病毒产品如果已经开展研究证明聚集体对产品安全性和有效性无影响，则可考虑不纳入产品相关杂质控制。另外，某些分子变体虽然发生了核苷酸和（或）氨基酸上的变化，但经过研究证明未对产品的复制特性、溶瘤活性和体内生物学效应产生影响，也可能不能直接归类到工艺相关杂质。因此，为兼顾到不同的产品特点，指导原则中对工艺相关杂质和工艺相关物质的定义进行了说明，即把可能影响到产品安全性和（或）有效性的物质归类为工艺相关杂质，建议采用适宜的方法进行残留量检测，并进行安全性评估，必要时考虑纳入质量标准；研究数据表明对产品安全性和（或）有效性无影响的物质归类为工艺相关物质，需要在合适的阶段进行监测，以确保批间一致性。
4、结语
本文较为系统地介绍了《溶瘤病毒产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》的制定背景、一般要求、需要关注的主要问题，希望有助于业界更好地理解和应用该指导原则。由于溶瘤病毒产品创新性较强、发展较快，指导原则起草小组对其认知也较为有限，因而指导原则中相应的技术要求仅基于当前技术发展和科学认知，随着科学的发展、对此类产品认知的不断深入，起草小组会适时修订该指导原则。
引用本文：崔靖，韦薇，何伍＊.《溶瘤病毒产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》解读[J].中国食品药品监管.2023.05（232）：24-31.
