绘制中枢神经系统的长期稳定活动图对于神经科学、解决神经系统疾病以及开发用于神经义肢和通信的高带宽脑机接口都非常重要。然而，绘制神经活动图具有挑战性，因为中枢神经系统的功能不仅在数月或数年内跨越多个区域和组织深度，而且还涉及需要在毫秒和微米尺度上量化单个神经元的电活动。在现有技术中，植入式微电极阵列可同时测量数千个单个神经元的毫秒级细胞外动作电位。通过3D堆叠或集成 CMOS（互补金属氧化物半导体）多路复用电路，可进一步增加电极数量。然而，由于植入电极与脑组织之间存在巨大的机械和结构差异，探针漂移、慢性组织损伤和免疫反应限制了它们在长期稳定记录同一神经元电活动方面的时间扩展性。记录神经系统中神经活动的电子设备需要在大空间和时间尺度上具有可扩展性，同时还要提供毫秒级和单细胞的时空分辨率。然而，由于传感器密度和机械灵活性之间的权衡，现有的高分辨率神经记录设备无法同时实现空间和时间层面的可扩展性。
来自美国哈佛大学的刘嘉团队开发了一种基于全氟介电弹性体和组织级的具有柔性多层电极的3D堆叠植入式电子平台，它能在神经系统中实现时空可扩展的单细胞神经电生理学。本研究的弹性体在生理溶液中可保持一年以上的稳定介电性能，其柔软度是传统塑料介电材料的 10,000 倍。利用这些独特的特性，本研究开发出了以3D配置封装光刻纳米厚电极阵列的方法，其横截面密度为每 100 µm2 7.6 个电极。由此产生的3D集成多层软电极阵列保持了组织级的灵活性，减少了小鼠神经组织中的慢性免疫反应，并证明有能力在不干扰动物行为的情况下可靠地跟踪小鼠大脑或脊髓中长达数月的电活动。相关工作以题为“3D spatiotemporally scalable in vivo neural probes based on fluorinated elastomers”的文章发表在2023年12月22日的国际顶级期刊《Nature Nanotechnology》。
【通讯作者简介】
哈佛大学刘嘉课题组的目标是通过各种尺度将电子学与生物学结合起来。为了实现这一目标，本课题组汇集了生物工程、电子工程、化学、生物信息学、计算机科学以及材料科学和机械工程等领域的专家，利用纳米电子学、软材料和基因工程与半导体工业兼容的光刻技术相结合，开发可扩展的生物电子学平台技术。课题组的目标是将这些可扩展的生物电子技术与机械人工程、单细胞基因组学、成像和计算分析相结合，将电子学与生物学无缝结合，将机器智能与自然智能融为一体。利用这一平台技术，本课题组开发出能够跟踪和控制活生物体和行为动物体内单个细胞多模式活动的工具，这些活动具有细胞类型特异性，可跨时间和空间对大量细胞进行统计。利用本课题组专业的实验和计算知识，旨在了解单细胞多模式生理学和基因表达的群体动态与整个器官和生物体的功能和功能障碍之间的关系。本课题组的研究涉及脑机接口、神经工程、干细胞工程、心脏疾病和发育障碍等领域的问题。2022年，刘嘉入选《麻省理工科技评论》“35岁以下科技创新35人”全球榜单。
1. 创新型研究内容
本研究通过3D集成薄膜组织级软微电极阵列（图 1b），推出了一种时空可扩展的神经探针（图 1a）。本研究克服了软介电弹性体在生理溶液中作为钝化层的内在不稳定性，使用了具有高疏水和低分子溶解度的含氟弹性体，这大大减少了来自周围生物流体的离子扩散，从而实现了在生物流体中长期稳定的介电性能。具体来说，本研究开发了一种基于全氟聚醚 (PFPE) 的弹性体，作为一种弹性光图案介电材料。这种基于全氟聚醚（PFPE）的光图案介电材料（1）比传统的硬塑料封装材料柔软 10,000 倍，同时保持相同水平的纵向介电性能；（2）能够进行微米分辨率的3D光刻多层纳米制造；（3）与纳米级厚度的金属沉积工艺相兼容。3D堆叠微电极阵列可以通过3D堆叠增加电极的数量和密度，同时保持组织级的灵活性和机械坚固性，并能在数月内以单机-单尖峰分辨率稳定跟踪电活动，同时减少免疫反应，这证明了其在神经电生理学的空间和时间尺度上的可扩展性（图 1c）。
本研究的设计基于以下理由。在不改变探针柔性特性的前提下增加电极密度的方法之一是大幅缩小互连尺寸。然而，这会带来串扰和信号衰减等挑战。另一种方法是使用薄膜晶体管进行现场多路复用以增加电极密度，但其机械刚性和在生理溶液中需要较厚的无机钝化层限制了其在组织级柔性神经探针中的应用潜力。第三种方法是通过垂直堆叠3D电极阵列来增加电极密度（图 1d），但这需要采用低模量电子材料来保持整体灵活性。
图1 用于时空可扩展体内电生理学的植入式神经探针
【生物流体中长期稳定的软封装】
传统的介电弹性体可用作生物电子学的软封装材料；然而，由于生理溶液中的离子会逐渐渗透到弹性体中，它们的长期封装性能受到了限制（图 1h,i）。本研究团队之前的研究表明，它们的电化学阻抗在生物液体中会急剧下降，从而降低封装电极的截止频率。这种不稳定性主要是由生物流体中的离子扩散到弹性体中造成的（图 2a），因为软聚合物的分子渗透性通常比塑料和无机物的分子渗透性高几个数量级。聚合物的离子传导性与其扩散性和溶解性成正比。本研究利用分子动力学（MD）模拟研究了水和氯化钠在不同介电弹性体中的扩散，以更好地理解这一离子扩散过程，并确定可能解决这一问题的材料系统。本研究的 MD 模拟显示，在 37℃时，含氟弹性体（PFPE-DMA 和 PHFIPA）中水、钠离子和氯离子的分子扩散率低于传统弹性体（PDMS 和 H-SEBS）（图 2b）。这种较低的扩散率表明，含氟弹性体的离子传导率可能低于传统弹性体，这可能使它们在生理溶液中长期浸泡时保持介电性能。为了验证这一假设，本研究系统分析了八种不同介电材料的长期电化学稳定性，其中包括三种含氟弹性体（PFPE-DMA、PHFIPA 和聚[2-(全氟己基)乙基]丙烯酸酯 (PPFHEA)）、三种非含氟弹性体（PDMS、H-SEBS 和聚异丁烯 (PIB)）以及作为对照的两种塑料介电聚合物（聚酰亚胺 (PI) 和 SU-8 2000.5 (SU-8)）。
本研究使用电化学阻抗光谱（EIS）和外部电解质电导测量（EEC）技术评估了介电聚合物的离子电导率（图 2c）。本研究使用具有导电损耗的电介质材料电学模型，根据 EIS 数据估算离子电导率。为了进行加速老化试验，本研究将聚合物薄膜浸泡在 10 倍 PBS 溶液中，温度为 70℃。浸泡前后归一化电化学阻抗 (Z) 的 Bode 图显示，在 0-1,000 Hz 范围内，传统弹性体和 PI 薄膜的阻抗大幅降低，而 SU-8 和含氟弹性体薄膜的阻抗则略有降低。在低频（<1,000 赫兹）下，所有含氟弹性体薄膜的阻抗模量降幅都低于 PDMS、H-SEBS、PIB 和 PI 薄膜。为了考虑由于样品厚度不同而导致的扩散时间变化，本研究绘制了 1 Hz 和 1 kHz 时阻抗模量的逐渐减小曲线（图 2d），作为时间（t）与聚合物薄膜平均厚度（H）平方的归一化函数。在 1 Hz 时，非氟化弹性体的归一化阻抗下降幅度更大。此外，本研究还从 EIS 图中推断出介质薄膜在 1,000-100,000 Hz 频率范围内的平均介电常数，证实 PFPE-DMA 的介电常数较低（ε = 1.99 ± 0.03），与之前的报告一致。
图2 作为软性长寿命电介质的氟化弹性体
【3D可扩展神经探针】
本研究开发了一种使用全氟聚醚-DMA 弹性体的3D光刻技术，并且将其用于可扩展的神经探针制造。传统的弹性体不适合多层光刻技术，因为在此过程中使用的有机溶剂容易导致弹性体膨胀，从而损坏薄膜微结构和微电子元件。然而，PFPE-DMA 弹性体已显示出化学正交性，既能抵抗有机溶剂，也能抵抗水性溶剂，即使在密集的纳米加工后仍能保持其表面。然而，与其他传统光图案化介电材料的高接触角以及与金属的低表面粘附能阻碍了在 PFPE-DMA 弹性体上直接图案化金属。此外，交联过程中对氧气的敏感性也限制了基于掩模的 PFPE-DMA 弹性体光刻图案的分辨率。
为了克服这些挑战，本研究开发了以下先进技术：(1)可3D打印的氮气扩散器与传统光刻机集成，在紫外线（UV）照射期间形成惰性气氛，从而实现 PFPE-DMA 的微尺度光刻；(2) 光刻隔板可防止 PFPE-DMA 前驱体与光罩直接接触，从而在光刻过程中保持 PFPE-DMA 薄膜的纳米级平滑度；（3）用惰性气体等离子体处理，以减小光刻胶的接触角，增加与其他材料的附着力；以及（4）高压溅射金属氧化物/金属层，以沉积金属线，防止金属离子扩散到 PFPE-DMA 中。可以重复(1)-(4)工序来制造多层微电子结构。重要的是，这些创新技术使 PFPE-DMA 能够在标准洁净室中作为负光刻电介质材料进行加工，从而使 PFPE-DMA 成为一种可与 3D 电子产品的传统光刻工艺兼容的弹性体（图 3a）。
图 3b 显示了玻璃毛细管上带有 64 个电极的神经探针的灵活性。相应的明场（BF）光学图像显示一个探针包含六层 PFPE-DMA 夹层四层金属电极（图 3c、d）。扫描电子显微镜（SEM）成像用于确认十层制造工艺后 PFPE-DMA 介电层的光滑表面。本研究对 PFPE-DMA 特征的横向分辨率达到了约 1 µm，表面处理使标准光刻胶能够在 PFPE-DMA 薄膜上确定精确的特征。值得注意的是，即使单轴拉伸到 20%，PFPE-DMA 和金属层之间也没有分层（图 3e）。粘附测试表明，PFPE-DMA 层的自粘附能大大高于其与玻璃基底的粘附能，并且更接近于所测得的固有断裂韧性，这表明两个 PFPE-DMA 层粘附牢固，在应变下不易分层。在单轴拉伸大于 20% 后，64 通道四金属层神经探针上未观察到层间分层现象。此外，在生理盐水中加速老化也不会诱发全氟聚醚-DMA 和金属层之间的分层。
图3 3D集成高密度软微电极阵列，实现可扩展的神经探针
【长期稳定的神经电生理学】
本研究将神经探针植入小鼠大脑进行长期记录。软神经探针是按照传统的方法送入大脑的。PFPE-DMA 探针垂直整合了四层电极阵列，横截面积约为超柔性探针的 150-500 倍，因此可以在一个探针中高密度植入 64 个电极（图 4a）。本研究比较了多层 PFPE-DMA 探针和相同厚度的 SU-8 探针的脑免疫反应（图 4b、c）。在植入后 12 周，观察到与 SU-8 探头相比，PFPE-DMA 探头周围的 NeuN（神经元）信号明显增强。此外，与 SU-8 探针相比，植入后 12 周 PFPE-DMA 探针周围的星形胶质细胞和小胶质细胞的荧光强度明显降低。然而，小胶质细胞信号的差异微乎其微。这些结果表明，3D垂直堆叠多层 PFPE-DMA 探针能与脑组织保持长期的生物相容性。慢性记录（图 4d、e）显示，在十周的植入期内，单个单元动作电位的记录非常稳定，棘间期（ISI）分布（图 4f）和波形形状（图 4g）的变化极小。此外，主成分分析（PCA）显示，从植入后两周到十周，所有单元在第一和第二主成分平面（PC1-PC2）上的位置几乎保持不变（图 4h）。此外，振幅、点燃率和波形相似性在所有记录过程中都保持不变，这表明高密度多层软探针可以长期稳定地跟踪来自相同神经元的活动（图 4-i-k）。本研究还使用带有单层电极阵列（约 2 微米厚的 PFPE-DMA）的 PFPE-DMA 探头证实了脑记录的稳定性，从而进一步验证了超薄 PFPE-DMA 封装层在长期脑记录过程中的介电稳定性。
图4 通过可扩展的软神经探针实现长期稳定的脑电生理和植入，同时减少免疫反应
PFPE-DMA 介电层的可拉伸性使多层神经探针能够承受更大的应变，在弯曲过程中对组织造成的机械损伤更小。为了证明这一点，本研究对小鼠脊髓进行了慢性电生理学研究（图 5a）。首先比较了 PFPE-DMA 和 PI 探针与假手术对照组的免疫反应，从而确定了长期免疫反应的特征（方法）。厚度为 25 μm 的 PI 探针被用作柔性脊髓植入物的标准探针，其坚固程度足以承受手术过程和长期植入。假手术组动物接受脊髓手术，但未植入装置。通过检测异物反应的星形胶质细胞（GFAP）和小胶质细胞（IBA1）的密度来评估慢性阶段的神经炎症反应，结果显示，在植入后六周，PI 探针附近的星形胶质细胞和小胶质细胞密度增加。相比之下，植入 PFPE-DMA 探针的小鼠与假手术动物没有明显差异（图 5b、c）。
本研究通过测量小鼠在开阔地箱中的自由移动以及在水平梯子上基本行走和熟练运动时的全身运动情况，确定了植入探针对动物行为的影响（图 5d）。统计结果表明，与假对照组相比，植入 PI 探针的小鼠在运动过程中的平均距离和平均速度都有所减少，同时还出现了运动障碍，而植入 PFPE-DMA 探针的小鼠则没有明显差异（图 5e）。利用植入的电极，本研究记录了几周内来自代表性电极的尖峰样电活动（图 5f），其发射率的变化与动物的静息和行走状态相对应（图 5g、h）。观察到的尖峰表现为持续时间延长（2-4 毫秒）和振幅增大（250-500 微伏）。这种现象以前在小鼠脊髓深度探针记录中也曾出现过。然而，要确定这些尖峰是多单位动作电位还是局部场电位，还需要进一步研究。这些结果表明，植入小鼠脊髓的 PFPE-DMA 软神经探针不会影响动物的行为，并能稳定记录脊髓电活动。
图5 长期稳定的脊髓记录
2. 总结与展望
本研究表明，可以用四层氟化弹性体/金属结构制作神经探针。基于欧拉-伯努利梁理论的分析模型显示，多达九层的探针弯曲刚度低于 1 µN m，而由塑料电介质封装的探针只有三层电极，弯曲刚度高于 1 µN m。在实践中，厚度超过 10 微米的塑料探针会变脆，而由弹性体封装的探针在植入时则会保持柔韧性和坚固性。研究表明，与薄的硬塑料探针相比，横截面更大的超软神经探针可实现长期稳定的神经记录。这些超软探针可以支持更多通道。本研究发现，金层和全氟聚醚-DMA 层之间的极度模量不匹配可能会导致中性轴的分裂，从而降低弯曲刚度。不过，基于以前工作的分析模型表明，欧拉-伯努利理论仍然适用于探针的大部分长度。实际上，扩展这些探针的主要限制可能来自微加工方面的挑战。当介质层的弹性模量低于兆帕斯卡水平时，它对探针总挠曲刚度的贡献微乎其微，金属层在探针的机械性能中占主导地位。因此，随着层数的增加，优势也会逐渐减少，因为离中轴较远的金属层对探针挠曲刚度的贡献更大。为了降低这种刚性，可以考虑采取一些策略，例如调整金属层的位置、增加外层弹性体厚度以防止信号泄漏或使用液态金属等较软的导体。
文章来源：
https://www.nature.com/articles/s41565-023-01545-6
https://liulab.seas.harvard.edu/
