为了微生物检验的顺利开展，最大限度地避免杂菌污染，需要我们熟练并规范地进行无菌操作，无菌操作是试验成功的关键，必须严格遵守操作规程，以确保实验的顺利进行。

 

一、无菌操作技术

 

1、定义　

 

是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法；

 

无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是保证微生物实验准确和顺利完成的重要环节。

 

2、内容

 

无菌操作技术主要包括两方面：

 

1）创造无菌的培养环境。包括提供密闭的培养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌等；

 

2）在操作和培养过程中防止一切其它微生物的侵入的措施。包括紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器皿灭菌、操作方法等。

 

3、无菌操作原则

 

1）在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区，接种时必须穿工作服、戴工作帽应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球将手擦干净；

 

2）在操作前20～30分钟要先启动超净台和紫外灯，进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼3次后使用。严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的钳、镊子等；

 

3）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不能触及试管或平皿边；

 

4）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒；

 

5）接种环或接种针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必须时还要烧到环和针与杆的连接处；

 

6）吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。倾倒平板应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。

 

二、无菌操作的环境要求

 

1、无菌室

 

（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间；

 

（2）无菌室的消毒和防污染

 

每日（使用前）紫外线照射（0.5~1小时）； 

每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒；

每季度用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时），特殊情况下可增加熏蒸频次。

（3）无菌室使用要求

 

①无菌室内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，拭擦工作台面，不得存放与实验无关的物品；

 

②无菌室使用前后应将门关紧，打开紫外线，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻拭擦，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响；

 

③处理和接种食品标本时，进入无菌室操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。在无菌室内如需要安装空调时，则应有过滤装置。

 

2、超净工作台

 

超净台的使用与保养：

 

（1）风速稳定，且符合要求；

 

（2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上；

 

（3）让超净台预工作10－15分钟；

 

（4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净。

 

3、无菌器材

 

（1）灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等；

 

（2）消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台、手等。

 

（3）无菌间一般只允许放置无菌操作台、转椅等物品；无菌操作台上一般只允许摆放以下物品： 酒精灯、打火机、接种针、消毒棉球、洗耳球、镊子、油性笔、灭菌平皿、试管架、灭菌吸管、电子天平、250ml灭菌三角瓶、培养基、均质器等。

 

三、无菌操作的基本技术

 

1、无菌接种操作

 

培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。

在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。

 

 

 

 

1. 接种针灼烧灭菌

进入超净工作台前，用75%酒精擦拭双手，进入超净工作台内，待酒精挥发完全，点燃酒精灯，将接种环及金属棒在火焰上灼烧，将接种环烧至发红，来回灼烧金属棒，尤其是接口处。

 

2. 接种针冷却

 

接种针灭菌后，移到酒精灯旁边冷却，备用。

 

3. 接种针接种

配制好固体或液体培养基后，利用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，经过灭菌后培养基里无任何微生物，在超过经工作台内，用接种针等将目标菌种接种到培养基中的过程。

 

划线分离：

 

由接种环沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。

 

①取菌种：取出目标菌种，融化后，备用；

 

②接种针灭菌：灼烧接种针进行灭菌；

 

③接种针冷却：将接种针移至酒精灯旁边冷却；

 

④蘸取菌种：甘油管用75%酒精消毒，待酒精挥发完全，在酒精灯火焰略微灭菌（防止烤糊），然后用接种环蘸取一环菌种；

 

⑤划线：取已经备好的固体平板，边转动平板边用酒精灯火焰灭菌，打开平板（靠口朝酒精灯），用上述接种环在平板上划线，先在一侧连续划线3-4次，边转动平板边用酒精灯灼烧接种环，冷却后，用接种环穿过第一次划线部分继续划线3-4次，同样方法进行第三次划线，或第四次划线（根据菌液浓度和菌种类型确定划线次数），灼烧接种环；

 

⑥标记：在平板底部边缘处标记菌种名称，日期和其他信息；

 

⑦培养：放置于恒温培养箱中培养；

⑧保存：待培养完成后保存于4℃冰箱，待用。

 

涂布法接种：

先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，然后用无菌吸管吸取0.1ml 菌液接种在已凝固的琼脂平板上。再用无菌L 型玻璃棒将菌液在平板上涂抹均匀，将涂抹好的平板平放于桌上20~30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落后即可计数。  

 

斜面接种：

从生长好的平板菌种转接到新鲜斜面培养基上的接种。主要用于接种纯菌，使其增殖后用以鉴定或保存菌种。

 

①取菌种：取出目标菌种平板；

②接种针灭菌：灼烧接种针进行灭菌；

③接种针冷却：将接种针移至酒精灯旁边冷却；

④挑取菌种：在火焰旁打开平板塞子，边转动平板边用酒精灯火焰灭菌，打开平板（靠口朝酒精灯），立即将接种环伸入平板上，挑取单菌落后盖上平板盖子，然后左手迅速取出新鲜试管，在火焰旁右手小指取下塞子，并灼烧试管管口，将黏有单菌落的接种环迅速放进新鲜斜面的底部，从下至上Z字划线，盖上试管塞，灼烧接种环；

⑤标记：在平板底部边缘处标记菌种名称，日期和其他信息；

⑥培养：放置于恒温培养箱中培养；

⑦保存：待培养完成后保存于4℃冰箱，待用。

 

液体接种：

将接种环送入液体培养基时使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，塞上试管塞再轻轻摇匀。

 

多用于增菌液进行增菌培养，也可用纯培养菌接种液体培养基进行生化试验，其操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同。

 

倾倒法接种：

吸取1ml 菌液加入平板中，倒入已融化并冷却至45~50℃的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养。至长出菌落后即可计数。

 

螺旋接种法：

可以在无任何全部或中间稀释的情况下快速细菌接种。对数减少的样品容量以阿基米德螺旋线的形式被自动分注在旋转式培养基表面。培养基上每一点的容量可以被知晓和校准。菌液的浓度可以通过培养皿上一定区域的菌落数量除以同区域样品分注量来计算。  

 

四、微生物检验过程中的注意事项

 

（1）在操作中不应有大幅度或快速的动作；

（2）使用玻璃器皿应轻取轻放；

（3）在正火焰上方操作；

（4）接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；

（5）在接种培养物时，协作应轻、准；

（6）不能用嘴直接吸吹吸管；

（7）带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。

文章来源：《食品微生物检测实验技术》周红丽等主编 中国标准出版社出版；