测定杂质含量时，可以选择杂质对照品法（外标法或内标法）、加校正因子的主成分自身对照法和不加校正因子的主成分自身对照法。对于加校正因子与不加校正因子的主成分自身对照法，应对校正因子进行研究。本文就主成分自身对照法方法学验证与大家一起探讨，仅供大家参考。

 

一、概述：主成分自身对照法

 

1、加校正因子主成分自身对照法

 

在自身对照法中，样品配制同面积归一化法中样品溶液配制，同时将高浓度的样品溶液进一步稀释成低浓度溶液。将高浓度和低浓度样品溶液分别记录色谱图。采用高浓度图谱中的有关物质峰面积与低浓度的样品溶液图谱的主峰峰面积进行比较计算杂质含量。加校正因子主成分自身对照法即为供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积分别乘以校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，计算各杂质含量。一般来讲，HPLC定量测定中，物质的检测量W与色谱响应值（峰面积等）A之间的比值称为绝对校正因子，即单位响应值（峰面积等）所对应的被测物质的量（浓度或质量）；而某物质i与所选定的参照物质s的绝对校正因子之比，即为相对校正因子，即通常所讲的校正因子。

 

一般情况下，校正因子可视具体情况通过如下几种方法确定：

 

（1）单浓度点测定（2）多浓度点测定（3）标准曲线法测定（4）吸收系数比值法。该四种方法的测定在张哲峰老师《HPLC法校正因子研究中的几个问题》有详细介绍。中国药典2015版0512高效液相色谱法中校正因子提到用单浓度点测定和标准曲线法测定。

 

单浓度点校正因子测定公式：

 

Ca为待测物的浓度；

 

Aa为待测物的峰面积或峰高；

 

Cb为参比物质的浓度；

 

Ab为参比物质的峰面积或峰高；

 

标准曲线法校正因子公式：

 

校正因子=有关物质斜率/原料药斜率

 

注意：加校正因子的主成分自身对照法应对校正因子进行严格测定，该方法适用于相对响应因子在0.5～1.5范围内的已知杂质的控制；超出0.5～1.5范围时，宜采用杂质对照品法或调整检测波长使杂质的相对响应因子落在0.5～1.5范围内。

 

1、不加校正因子主成分自身对照法

 

不加校正因子的主成分自身对照法的前提是假定杂质与主成分的响应因子基本相同，相对响应因子在0.9～1.1范围内，可以采用主成分自身对照法；超出0.9～1.1范围时，宜采用杂质对照品法或加校正因子的主成分自身对照法。峰面积归一化法简便快捷，但是，因各杂质与主成分的响应因子有差异、杂质量与主成分量不一定在同一线性范围内、仪器对微量杂质和常量主成分的积分精度及准确度不相同等因素影响定量的准确性，一般不建议采用。

 

二、加校正因子主成分自身对照法方法学验证探讨

 

《中国药典》2015年版，在《药品质量标准分析方法验证指导原则》中新增了对校正因子的验证，同时对验证结果做了严格的规定。现就加校正因子的自身对照法验证方式和可接受范围结合自身工作经历提出一些看法，供大家参考。

 

1. 专属性专属性：系指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）存在下，采用的分析方法能正确测定被测物的能力。有关物质方法的专属性实验一般包括空白干扰实验、系统适用性实验和降解实验三部分。

 

1.1 空白干扰实验：国家食品药品监督管理局药品审评中心《药品技术评价文集（第二辑）》要求空白无干扰，即空白溶剂或空白辅料不干扰本品有关物质的测定。

 

1.2 系统适用性实验 系统适用性实验通常采取分离度实验的方式进行评估，即根据已知杂质的限度配置限度浓度的加杂供试品溶液，考察已知杂质与供试品、各已知杂质及已知杂质与未知杂质间的分离度。要求各已知杂质与供试品及已知杂质间达到基线分离，已知杂质与未知杂质间的分离度大于1.0。

 

1.3 降解实验 将供试品在较为剧烈即在酸、碱、氧化、高温（干热和湿热）、光照等条件下进行适当的降解进而考察方法的可行性。

 

1.3.1 降解程度 RagineMaheswaran推荐的降解强度为5%～20%； 《化学药物分析方法验证的内容和评价》中的推荐值为20%～30%；《国家药品标准工作手册》的推荐值为5%～10%。强制降解实验是模拟药品在生产、储存和使用过程中的极端条件，现实中是极难发生的，同时如果过度降解极有可能造成二次降解致使物料不平衡故建议以低强度长时间（最长时间不建议超过七天，以三天内为宜）的方式进行降解实验以最大可能地模仿现实条件，降解程度以5%～10%为佳，但是对于降解条件已较为剧烈却仍未降解的建议不再加剧降解条件，如各条件均未产生降解产物的建议对相对较不稳定的条件加以复合条件进行进一步考察，以期望能有一条件出现降解产物以验证方法的专属性，如复合条件亦无降解产物产生则不再强求。

 

1.3.2 分离度 参照系统适用性实验要求，主峰与相邻杂质峰达到基线分离，已知杂质与未知杂质及各未知杂质间分离度大于1.0。

 

1.3.3 峰纯度 峰纯度主要是考察被分析峰中是否包含其他物质，现有仪器参数具有一定的局限性，无法完全真实地反应实际情况，参考现有仪器的表示方法建议规定主峰纯度因子不小于990，或者纯度阈值大于纯度角。

 

1.3.3 质量守恒 《国家药品标准工作手册（第四版）》与《药品技术评价文集（第三辑）》中均要求在±10%以内，本人认为范围过宽，如果排除人为误差，单单考虑仪器的误差将其定在±2%以内是比较合理的，但是考虑到降解程度为5%～10%，同时考虑到人为误差、仪器误差及校正因子因素，建议带入校正因子后将其定为±5%是更合理的。

 

2. 准确度  准确度系指采用该测定方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（%）表示。验证时一般要求根据有关物质的定量限与该杂质的限度分别配制三个浓度的供试品溶液各三份（如LOQ、50%、100%、150%）的同时配制自身对照溶液，按外标法和加校正因子的自身对照法分别测定其含量，将外标法测得值换算成百分含量与加校正因子的自身对照法的测量值进行比较以考察校正因子的准确度，将外标法的实测值与理论值比较，计算回收率，并计算回收率的相对标准偏差以考察方法的准确度。

 

参照ICH Q3A的相关要求，并结合质量研究的实际情况，对校正因子的准确度拟定如下可接受范围（X表示测得的杂质含量）：

 

① 当X＜0.05%，两测量值不做比较；

 

② 当0.05%≤X＜0.10%，两测量值的差值在0.05%内；

 

③ 当0.10%≤X＜0.50%，两测量值的差值在0.10%内；

 

④ 当X≥0.50%，两测量值的差值在0.20%内。

 

《药品技术评价文集（第二辑）》中规定各浓度下的平均回收率应在80%～120%，LOQ浓度下的平均回收率应在70%～130%，RSD不大于10%，此范围过于宽泛，而《中国药典》要求过于苛刻，极难达到，结合实际工作，对方法的准确度实验拟定如下可接受范围：

 

① LOQ浓度水平，每个样品的回收率均在85%～110%；

 

② LOQ以上浓度水平，每个样品的回收率均在92%～105%；

 

③ 含LOQ浓度各样品回收率的RSD应不大于10%，LOQ浓度水平以上的各样品回收率的RSD应不大于5%。

 

3.精密度  精密度系指在规定的条件下，同一份均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性；在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度，称为中间精密度。

 

一般我们采用加限度杂质浓度的供试品溶液，平行配制6份，按外标法和加校正因子的自身对照法分别测定已知杂质的含量。

 

校正因子的重复性和中间精密度拟定可接受标准为（X表示测得的杂质含量）：

 

① 当X＜0.05%，两测量值不做比较；

 

② 当0.05%≤X＜0.10%，两测量值的差值在0.05%内；

 

③ 当0.10%≤X＜0.50%，两测量值的差值在0.10%内；

 

④ 当X≥0.50%，两测量值的差值在0.20%内。

 

《药品技术评价文集（第二辑）》中规定重复性RSD不大于15%，重复性和中间精密度12份数据RSD不大于20%，范围过于宽泛。参照《中国药典》通则9101的精密度和ICH Q3A的相关要求，并结合实际工作，拟定可接受标准为：

 

① 当X＜0.05%，不计算RSD；

 

② 当0.05%≤X＜0.10%，RSD不得过4，不同实验人员测得值得RSD不得过8或差值不得过0.05%；

 

③ 当0.10%≤X＜0.50%，RSD不得过3，不同实验人员测得值得RSD不得过6或差值不得过0.10%；

 

④ 当X≥0.50%，RSD不得过2，不同实验人员测得值得RSD不得过4或差值不得过0.20%。

 

4.线性  系指在设计的范围内，测定响应值与试样中被测物浓度呈比例关系的程度。应在规定的范围内测定线性关系。可用同一对照品贮备液经精密稀释，或分别精密称取对照品，制备一系列对照品溶液的方法进行测定，至少制备5份不同浓度的对照品溶液。线性浓度溶液建议从定量限至限度浓度的200%。每份样品溶液进样一针， 以测得的响应信号对被测物的浓度作图进行线性回归，列出线性方程、线性图、相关系数、响应因子、y轴峰面积的截距及剩余标准偏差。

 

《药品技术评价文集（第二辑）》中规定相关系数不小于0.990，y轴截距应在100%峰面积的25%以内，响应因子的RSD不大于10%；《2010年版-实验室控制系统GMP实施指南》中规定相关系数原料不小于0.998、制剂不小于0.990，y轴截距应在100%峰面积的25%以内，当限度小于0.5%时剩余标准偏差不大于10%。结合现有研发实际经验，拟定如下标准：

 

① 相关系数不小于0.999

 

② y轴截距不大于100%浓度峰面积的10%

 

③ 响应因子的RSD不大于5%

 

④ 剩余标准偏差不大于10%

 

根据线性方程的斜率（k）比计算校正因子。即校正因子=k主成分/k杂质。其可接受标准为：

 

① 校正因子在0.9～1.1之间修约为1.0，当其小于0.9时保留小数点后两位，当其大于1.1时保留小数点后一位,另有规定的除外；

 

② 当校正因子为法定标准收载的，偏差在10%以内取法定标准数值，若偏差大于10%应考察其原因，经分析为非方法和人为误差引入的，则按实际测定值作为校正因子；

 

③ 当校正因子在0.2～5.0之外时需要考察方法是否需要可行或更换为杂质外标法。

 

5. 定量限和检测限  定量限（LOQ）是指试样中被测物能被定量测定的最低值；检测限（LOD）是指试样中被测物能被检测出的最低量。方法分为直观法、信噪比法和基于响应值标准偏差和标准曲线斜率法。

 

我们最常使用的是信噪比法，本人更推荐直观法，因为其更简单直接，只要灵敏度足够好，直观法更有利于操作的简便性和验证项目的通过（如定量限回收率的测定）。现就常用的信噪比法拟定如下标准：

 

① LOD和LOQ的信噪比分别拟定为2～4和8～12，在保证灵敏度的情况下可以将其适当放宽至2～6和8～15；

 

① LOD和LOQ的信噪比分别拟定为2～4和8～12，在保证灵敏度的情况下可以将其适当放宽至2～6和8～15；

 

② LOQ浓度样品连续进样6次峰面积的RSD不得过10%

 

③ LOQ一般为限度浓度的十分之一，最差为限度浓度的二分之一同时满足低于报告限浓度，考虑到常规药品的最大日剂量是小于2g的现状，LOQ应小于供试品溶液浓度的0.05%。

 

6.耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的成熟程度。

 

6.1 溶液稳定性

 

一般我们需要对供试品溶液、对照品溶液及对照溶液进行稳定性考察，考察时间取决于实际样品检测最长时间、方法学验证项目中耗时最长项目时间（一般为耐用性）及溶液是否出现不稳定性。对于溶液稳定性小于4h的样品应临用新制并立即进样，低于2h的应考虑更换溶剂、改变放置条件（如进样盘控温）或更改检测方法。

 

对于对照品及对照溶液建议采用主成分峰面积RSD不大于2%进行判断。对于供试品溶液由于其杂质含量差异较大，如按照峰面积RSD不大于2%进行判断显然是不合理的，对其建议采用面积归一化法进行判断，并符合以下标准即认为供试品溶液是稳定的（X为面积归一化法计算杂质的含量）：

 

① 当X＜0.05%，两测量值不做比较；

 

② 当0.05%≤X＜0.10%，两测量值的差值在0.05%内；

 

③ 当0.10%≤X＜0.50%，两测量值的差值在0.10%内；

 

④ 当X≥0.50%，两测量值的差值在0.20%内。

 

6.2 耐用性试验

 

一般选择对3～5个相关的测定条件进行微小的变动，一般对下列条件进行微小的改变，流动相比例（±5%，如为两项预混流动相，则起始比例的改变不得超过低比例流动相的10%）、pH值（±0.2）、波长（±2nm）、不同品牌或同一品牌不同批次的同类型色谱柱、缓冲盐浓度（±5nmol）、柱温（±5℃）、流速（±0.1ml/min）等。按照常规实验要求取空白干扰溶液、系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液、对照溶液等进样，考察色谱条件微小改变后空白干扰现象、系统适用性（以分离度为主，拖尾因子、理论板数等为辅）及各杂质的含量的变化情况。

 

校正因子的耐用性结果良好结果要求参照精密度项下要求即以外标法和加校正因子自身对照法计算杂质含量（X）应符合以下要求：

 

① 当X＜0.05%，两测量值不做比较；

 

② 当0.05%≤X＜0.10%，两测量值的差值在0.05%内；

 

③ 当0.10%≤X＜0.50%，两测量值的差值在0.10%内；

 

④ 当X≥0.50%，两测量值的差值在0.20%内。

 

耐用性实验结果良好，需满足一下标准

 

① 空白溶剂或辅料不干扰本品有关物质的测定；

 

② 系统适用性溶液中各已知杂质与供试品及已知杂质间达到基线分离，已知杂质与未知杂质间的分离的大于1.0；

 

③ 按加校正因子的自身对照法计算所得杂质的含量（X）满足校正因子的耐用性实验结果良好的要求。

 

7.范围

 

系指分析方法能达到一定精密度、准确度和线性要求时的高低限浓度或量的区间。即范围由精密度、准确度和线性的结果所决定。2015年版《中国药典》规定是限度的±20%；ICH Q2规定是报告限到限度的120%或者是LOD或LOQ到限度；USP40的规定是限度的50%至120%。而范围一般是由线性研究所得，考虑到常规原料与制剂的限度区别同时为了减少工作量，故建议线性范围为LOQ至原料限度的300%。

 

主成分自身对照法由于其避免了面积归一化法的弊端，又不需要杂质对照品，是目前使用最广的有关物质分析方法。根据有关物质校正因子的大小来确定是否需要加校正因子。一般情况下，校正因子在0.9～1.1时可不予校正，直接采用不加校正因子的自身对照法定量；超出该范围，如采用主成分自身对照法的定量方式，须用校正因子进行校正，即“加校正因子的主成分自身对照法”以保证杂质定量的准确性；如校正因子在0.2～5.0范围以外时，表明杂质与主成分的UV吸收相差过大，校正因子的作用会受到显著影响，此时可改变检测波长等检测条件，使校正因子位于上述范围内，或使用结构或UV吸收与该杂质接近的另一标准物质为参照物质（如对照品易于获得、标准已采用对照品外标法定量的另一特定杂质），重新确立校正因子；如校正因子仍无法调节至适当范围，需考虑采用杂质对照品外标法等适当的杂质方式定量。

 

方法验证是药品质量控制研究重要的组成部分，通常要贯穿药品研发的始终。方法验证应围绕验证目的，根据测试项目的要求，结合所用分析方法的特点确定相应的验证内容;同时要注意验证试验的过程应严谨、规范。另外，随着药品研发的进展及在研发过程中的变更情况进行必要的方法再验证，以不断完善分析方法，同时适用于变更后产品的质量控制。 外标法、主成分自身对照法、面积归一化法是目前常用的三种有关物质测定方法，其中主成分自身对照法由于其无需杂质对照品和避免面积归一化法的弊端最常用。可根据实际情况选用合适的定量方法。