清洁验证的目的是为了证明清洁程序的高效性与一致性。选择产品残留、清洁剂、微生物污染，以及其他任何工艺成分的限度，逻辑上应该基于物料对生产流程和产品的安全性和纯度的影响而定。清洁生产系统和成分的可接受限度应该“切合实际、可达到、可证实”。

清洁验证的限度一般包含与活性蛋白 （或者其他的主要物质成分） 相关分析、与清洁剂相关的分析、与生物负载水平相关的分析、与内毒素水平相关的分析，以及设备目检清洁要求。另外，如果存在任何与活性蛋白或者其他工艺组分相关的特别毒性物质（例如细胞毒性、变应原性、或者生殖危害物），那么生产商的毒理学或生理学团队就需要确定是否有必要改变限度，或者是否需要使用专用的设备。在接下来的讨论中，限度的考虑应该基于自然残留和生产的各个阶段（例如，原液 vs.配制/分装）。生产阶段包括主要原液生产（所有的步骤是为了获取活性药物）和配制/分装（将原液加入到成品的制剂以及药品物质的初级包装）。原液的生产进一步分为上游生产步骤（收获药物前的所有步骤）和下游生产步骤（药物纯化以及后续步骤）。

1、活性物限度的关键问题

生物技术的清洁过程经常涉及到活性分子本身的改变，因为这些活性物质通常是蛋白质。在生物制品制造通常应用的清洁过程中，蛋白质都会在一定程度上发生降解。下面就总结一下最主要的降解机制。在碱性溶液中，尤其是高温，溶液中含有氢氧化钠和氢氧化钾，蛋白质就会水解成可溶的寡聚物或者自由氨基酸。活性物质上的酯基团水解为一个醇和一个脂肪酸，一个最为普遍的例子就是将脂肪和油脂转化为甘油和脂肪酸的皂化反应。次氯酸钠有时会用于生物技术清洁， 作为一种清洁剂， 它能非常有效地从表面去除变性蛋白质残留。

它是一种活泼的氧化剂，它能够使蛋白质更随机地降解为更小的片段。使用次氯酸钠时通常关注其对不锈钢成分的危害作用。因此， 关键的是，使用次氯酸钠后的漂洗循环能将氯离子残留冲洗干净，然后再进行酸清洁。在高 pH 下蛋白会水解，控制时间和温度参数都会在很大程度上影响蛋白质的水解。因此，pH 和温度越高，蛋白就越容易发生水解。因为蛋白通常降解为更为小的片段，这些小片段趋向于高度极化，他们更加易于溶于水，也更加容易通过清洁、漂洗的过程从设备表面去除。蛋白质暴露于高 pH 的第二个效果就是，水解导致其生物学活性的下降可能是一个不可逆的、显著的过程。

活性物的降解可以在实验室中验证，通过将活性物质暴露在模拟清洁条件（或者强度更低的条件）的清洁溶液中，然后对生成的混合物进行分析和/或者生物化学的测试。基于这些原因，在大多数情况下生物技术制造商在清洁验证流程中并不直接设置活性限度，或者直接检测活性。由于活性物质的降解，在清洁过程完成后，应该不会有活性物质的残留。正是出于这个原因，人们用像 TOC{总有机碳（Total organic carbon）}的分析方法检测蛋白质的残留物 （或片段）。如像 TOC 的非特异性的方法被用于活性物质残留的检测等相关使用， 应该指出，清洁后真正的蛋白质残留是非常低的，因为 TOC 检测的是所有的有机碳源（并不仅仅是来源于活性蛋白的残余）。

1.1 在制剂和最终分装中建立活性物限度

在生物技术产品的制剂和分装生产中，蛋白质活性限度的设定是用污染(传递)量计算(通常称为MAC，或最大可允许的传递量)，跟小分子清洁验证使用同样的方法。虽然产品降解(如上所述)，计算是基于活性产品的量。如果在制剂/分装所用的清洁方法导致了活性蛋白降解为小分子片段， 该方法就代表了最差的情况。考虑到降解作用，这个计算可以进行修正。只有当每日治疗剂量是已知的，才能应用这种方法。对于长期使用的产品，一个典型的方法是，在随后制造最大活性日治疗剂量的产品中，允许其携带不超过最小活性日治疗剂量的 1/1000；1/1000的因子可能根据特殊情况而修订。此外，如果计算允许在随后的药物产品中活性蛋白残留量超过10ppm，可以使用在下一批次的药物产品中，10 ppm 活性药物蛋白的限度。类似的标准在包括美国FDA(8)和 PIC/S 的指导文件中是有例子的。

然后单位面积的限度可以基于下一个最小批量的药物生产所共用的设备面积上计算出来。擦拭或冲洗样品中的限度可以通过采样的参数计算出来。当使用这个方法设定限度时，活性物的限制可以计算出来。然后它可以转换为分析方法适当的单位而被利用。例如，如果分析方法是 TOC，活性物质的限度可以通过转换为 TOC，即基于 TOC 在活性物质的含量（百分比）而计算出来。

应该指出的是，基于污染量（传递量）计算的限度是设置限度的“科学根据的”方法之一。一些公司选择基于更严厉的标准设定限度，例如用 WFI TOC 值 500ppb 作为标准。虽然这种方式是可以接受的，但是只有证明 WFI TOC 标准要比污染量计算的 TOC 结果更加严格，才可以使用这种方法。

1.2 在原液生产中建立的活性物限度

用于制剂/分装的污染量计算通常不适用于原液的生产。主要的原因是如果污染量计算的方法是基于整个生产线的设备表面积，限度是极低的，除非药物活性成分在清洁过程中不会降解，否则是不能用现行分析技术测量的。

正如前面讨论的，活性蛋白在大多数情况下，都会在清洁过程中被降解。因此，即使典型的特异性方法可以在很低水平上测量活性物质，但是当活性分子降解后这些方法是不能使用的。

如上所述，活性物的残留一般都是像 TOC 一样通过“间接”测量某一特性（为了这个报告的目的，TOC 将作为此类分析方法的例子，尽管也可以用总蛋白测量之类的方法）。

通常清洁验证 TOC 的定量限度大约为 100-500 ppb 碳，与含碳量为 50%的约 200-1000 ppb 蛋白质的数值等效。因此说如果限度是基于整个设备链的表面积而计算污染量的，那么 TOC 是不能用作分析方法的。一些公司选择使用一些限制区域的表面积计算污染量，例如使用最后一个生产罐或用最后一步纯化工艺后的所有生产设备。这样的修订也许会导致计算的污染量，可以用 TOC 测定。这种方法的原理可以在 ICH Q7（药物活性成分的 GMP 指南）中找到；在指南的 12.7 章节中提到如果在随后的生产步骤中去除这些残留物，在早期的生产步骤中不需要验证。发酵和处理后的各种工艺步骤，包括层析纯化及超滤等，预期可以去除早期清洁过程中所留下的残留物，因为这些残留物通常是小分子片段。这一点对于一个特定的活性物还没有被证实，而是根据对蛋白质降解的理解以及生产工艺中所使用的各个纯化工序的了解，所做的一个合理假定。在污染量计算的依据中，应考虑活性蛋白的灭活。这将导致一个保守的限度，因为它假定降解碎片的药理学作用和/或安全考虑是远远低于天然蛋白质的。

由于这些测量问题，也由于降解的问题，一个更普遍的设定活性物残留限度的技术是基于工艺能力。这不是一个真正的工艺能力研究，而是基于在生物产品制造中已有的和传统的清洁操作程序来实现的。这些限度通常基于所有样品的 TOC 值，不论是冲洗或擦拭。作为一般规则，那些纯化工艺后的限度应更加严格。上游工艺的 TOC 限度通常会严格性差一些，因为设备表面清洁的产品会有更多外来材料的（例如细胞物质）。

可接受标准通常为下游工艺 TOC 1-2ppm 和上游工艺 TOC5-10ppm。就像其他清洁验证方案一样，应该注意，通常获得的数值应显著低于既定的限度。但是对于如超滤膜和色谱树脂这些产品专用材料来说是可以有例外的。这些都是下游工艺的一部分，但是可以设定更高的限度值。当这些对象只是专门用于制造一种产品时，更高水平的限度是可以接受的。

1.3 基于毒理学的限度

一种为制剂/分装或者原液生产而建立活性物限度的替代方法，是基于毒理学计算而建立的限度。这些活性物的毒理学计算与在下文第二部分第一小节市售化学试剂的限度中所提到的清洁剂毒理学计算是类似的。毒理学计算通常涉及活性物质短期的毒理学数据，最后到达一个 ADI（允许的日摄入量）。基于同一种用药途径（如果是注射给药的产品应通过静脉注射来研究）的毒理学数据计算会更好。如果数据是基于口服的毒理学，对注射药的清洁应要求增加安全系数。作为一个总的看法，这种基于对安全考虑而进行的计算，与基于剂量的计算相比，通常会导致较高的限度。此外，如果活性蛋白降解，更多的相关毒理学数据不是天然蛋白质的毒理学，而是降解碎片的毒理学，通常认为后者安全问题更少（虽然通常不会进行降解碎片的毒性研究）。

2、清洁剂的限度

清洁剂的限度也取决于生产的各个阶段（制剂/分装与原液生产）。典型的生物制药清洁程序包括强碱清洗以及下一步的磷酸物的清洗，或者是碱性清洁剂以及随后的酸性清洁剂。这些过程都是分开处理的。

2.1 市售化学试剂的限度

如果只有市售化学试剂如氢氧化钠和磷酸用于清洁，那么通常的做法是用电导率的值为其设定间接的限度。更好的做法是，氢氧化钠或者磷酸的可接受水平建立在毒理学的污染量计算或者是工艺参数的效果之上。然后电导率限度的设定水平就等同于在特定温度下的那个浓度。这种情况下用这种方法设置电导率的限度，通常要好于在相同温度下注射用水的电导率限度。因此，限度是基于注射用水的标准或者是稍高于这个标准（例如 5 μS/cm）。这种做法的原因是它要比“科学”计算的限定值更加严格。此外，在许多情况下，磷离子/或钠离子可能是随后制造出来产品的一部分。因此，少量的污染量并不明显。

还应指出的是，基于市售化学试剂的毒性计算是比较极端的，因为氢氧化钠并不会以氢氧化钠的形式污染到最终的产品中，磷酸也不会以磷酸的形式污染到最终产品的。如果这些化学物质以高浓度完整地污染下来，通过工艺检查（这样会引起 PH 的显著变化）也会发现这种不符合性。因此，目标并不要求与注射用水的标准一致，而是确认一个很低的清洁剂含量。而允许电导率限度略高于注射用水限度的原因是，注射用水的限度要求只是适用于管路中的循环注射用水。一旦从循环管路中取出水并通过清洁设备（尤其是通过喷淋装置时它可以从空气中摄取二氧化碳），不要期望它一定会满足 WFI 的电导率限度。

2.2 处方清洁剂的限度

对于制剂/分装制造，处方清洁剂（可能在无机氢氧化物中添加很多有机组分）残留量的限度通常是依据其短期毒性（LD50）数据而计算污染量的。这种毒性资料可提供的清洁剂制造商或可使用的计算制订成分分析的基础上最坏情况的假设。这种毒理学的资料可由制造商提供或使用基于处方成分分析得出的最差情况而计算。为了确定下一个药物产品中的限度值，如果处方清洁剂的默认值比污染量计算的值更加严格，也可以采用。

处方清洁剂的默认值一般为 10ppm。请注意活性物污染量计算与处方清洁剂污染量计算的差异在于对后续产品的污染限度计算方法不同，一个使用的是剂量比率，而另一个用的是半致死率 LD50 比率。一旦完成计算，随后的清洁剂计算使用与活性物同样的公式，来确定每个拭子或每个分析样品的限度。

对于原液生产，为活性物限度而讨论的一些问题也同样适用于清洁剂。也就是说，考虑到整个共享面积的污染量计算值是极低的，通常难以测量。但是，使用的处方洗涤剂通常在分离提纯等过程中可根据分子量去除（例如超滤或者是分子排阻色谱法）。就像活性成分的限度一样，毒性计算可能适用于下游纯化后的步骤或下游工艺的最后一个容器。

3、微生物限度

考虑到清洁后微生物的限度，不要预期清洁过程本身会导致设备的无菌结果。然而，即使如果设备进行在位灭菌或者是在下一产品生产前灭菌，通常的做法是评估微生物负载来确保随后的生产工艺不会过度挑战。只要达到一般的非无菌生产微生物限度标准（1-2CFU/cm2 表面取样方法）就已经是足够的。对于冲洗取样，一些公司将利用典型 WFI 的值（10 CFU/100 毫升），而其他公司将利用 100CFU/100 毫升或 1,000 CFU/100 毫升的值。设定较高的限度原因是随后设备将进行灭菌。此外，WFI的值是在管路中循环的注射用水值，一旦它从循环管路中取出并加到设备中时，并不要期望它能必然符合原有的注射用水值。

4、内毒素限度

在内毒素经各个去除步骤后，内毒素对最终产品的污染量是更值得关注的。在这种情况下，内毒素通常只在最后的冲洗水测定，限度设定通常是注射用水标准 0.25EU/ml。在细胞培养过程的内毒素去除步骤之前，冲洗水取样预期应该符合注射用水限度。对于用大肠杆菌进行的细菌发酵（革兰氏阴性细菌，在冲洗过程中能够生产大量的内毒素），在发酵和收获步骤后的清洗符合注射用水限度，是不可能完成的，这种情形下，其它公司在更高的水平设置内毒素限度，例如 5-25 EU/mL。实现这一水平表明清洁工艺得到控制，任何在这种水平上的可能污染量应在随后的内毒素清除工序中评价。

5、视觉清洁标准

产品表面的外观目测是核实残留物去除的一种直接衡量手段。外观目测也不是一种定量的方法，但是对于直接检查产品表面清洁非常有用。只要有路径可以到达关键的表面，外观目测很容易完成。它能确认生产设备重要区域的洁净程度。文献表明少量的残留（如果存在）是可见的和可被察觉的。如同在生物制药中所使用的，目测清洁标准能典型地用做清洁验证方案中的擦拭和/或冲液中残留物的测试。

6、修改限度

设立行动和/或警戒限度，作为日常工艺验证监测的一部分。这些值通常比验证方案中的合格/失败限度更加严格。依据工艺能力显示连续的低水平和维持这些水平的能力，可以进行风险评估并考虑为将来的验证方案采用更加严格的限度。

本文作者刘生巧，甘肃三泰绿色科技有限公司，来源于现代盐化工，仅供交流学习。