您当前的位置：检测资讯 > 科研开发
嘉峪检测网 2020-02-25 12:00
摘要
与其他精密仪器相比光学显微镜作为材料表征的常规手段在制药和精细化工领域被严重忽视。在样品制备方面光学显微镜无可争议的扮演着重要的角色，但其在固体性质研究方面一样可以发挥重要的作用。本文主要目的在于矫正（光学显微镜应用的）这种失衡同时旨在说明光学显微镜特别是偏光显微镜在大部分的材料表征中均应占有一席之地。对偏光显微镜的应用不应仅局限于理解所研究化合物的性质；其应当是有机和无机化合物发现和发展进而对其有全面了解这一过程中解决所遇见难题的一个不可或缺的工具。当采用多种技术手段研究化合物的固体性质时，偏光显微镜可为理解和解释其他技术手段所发现的现象提供巨大帮助。只需在不同倍数下观察少量样品即可获取价值非凡的信息这是其他非光学仪器所无可比拟的。偏光显微镜自身就是一个独立且强有力的技术手段，应当作为其他固体表征技术如XRD、热分析、固态核磁、振动光谱等的首要补充。本章重点放在偏光显微镜的实际应用以及为何成为其他工具的有力辅助。
为何使用光学显微镜研究固体性质？
显微观察在于通过对样品图像放大进而达到揭示单纯肉眼所不可见的信息的目的。当在光学显微镜上增加一个偏光滤镜其便成为可用来确定晶体光学性质和开展显微化学实验的分析工具。不同固体结构有着不同光学性质，如折射率、色泽、消光角、光色散的都可同光光学结晶的方法快速确定。光学性质由晶体自身的晶体结构和化学性质所决定，因此光学性质可提供许多有价值的的信息来支持通过其他方法获取的数据。此外通过偏光显微镜还可快速获取粒径、粒子性状、机械性质、孪晶、包合物、晶体生长和消融、介晶等信息。采用热台显微镜对少量样品进行加热或冷却即可观察到热学引起的现象如熔点、晶型转变、溶剂化物和升华等。除光学显微镜外还有许多其他显微镜用来探索和分析样品的物料和化学性质如配有X射线的电子显微镜、原子力显微镜（AFM）红外-拉曼显微镜、近红外显微镜及声学显微镜等。
偏光显微镜
偏光显微镜（图1）是在标本上方（检偏器）和下方（起偏器）各放置一个偏光过滤器而构成的复合显微镜。检偏器和起偏器处于正交位置。起偏器在光路中的位置总是位于样品和光源之间（通常与聚光器构成一体）以确保样品是通过偏振光被观察。检偏器被放置在光路中以便样品可采用交叉偏振检测。有些偏光显微镜的检偏器可进行旋转以便达到样品可在非交叉偏振条件下检测或者可对光学活性样品进行表征或利用专用的补偿板的目的。为了获得均一明亮的视野显微镜必须调整至（如果可能的话）Koler illumination条件。
图1 偏光显微镜示意图
为了保证在偏振光下可对样品进行全面的观察，显微镜必须配备可旋转的载物台，以便单个晶体可分别与检偏器和起偏器的振动方向保持一致。至少要有一个目镜具有十字线以便说明检偏器和起偏器的振动方向。在旋转载物台的边缘应当有刻度并且配备游标，以便对角度进行测量，比如晶面的角度或者晶体的消光角等。补偿器（比如色调板）作为一个有用的辅助可用来确定晶体其他的一些光学性质，一般安装在光路中检偏器的下方。
为了对晶体的固体性质进行研究而选定的偏光显微镜应有以下基本的配制：
显微摄影
显微摄影是记录显微镜对细小物质所成图像的技术。在检测一个样品是拍摄其所呈现的形态在将来的报告中作为参考或说明是极其有用的。相机通常安装在事先预留的三目镜头上或通过适配器与其中一个目镜连接。随着高性能数码相机的诞生，将其配备在显微镜上更使得显微摄影变得更简单快捷。但一个理想结果的获取与样品制备的好坏、对显微摄影基本技能的理解和运用同样密不可分，（仪器）优异的性能只是前提，专业的技能才是品质的保障。在图片中仅仅说明放大倍数是不够的，还必须要有比例尺，因为原始图像会因为图片大小的不同而改变，但比例尺是不受这些因素影响的。因为比例尺所代表的的大小是经过已知准确尺寸的镜台测微计（stage micrometer）或镜台计数线（ stage graticule）确定过的。专门用于显微镜的数码相机一般均会有比例尺自动叠加的功能。
样本制备
和所有的分析技术一样，样本的正确制备是检测结果有价值的前提。理想条件下，样本应具有足够的代表性，并且在样本制备过程中样品自身的状态和性质不会受到任何破坏。样品从晶体态的化合物到含有颗粒的粉末不一而足。粉末样品样本的制备相对简单，只需将其分散在合适的液体中，涂布于载玻片即可。但要想制备理性的样本，必须从一开始就要有明确的目的。比如想要分析样品粒径，必须保证样品和背景有足够的对比度（如果看不到它，怎么测量它）。样品和周围环境之间的都比度可以通过将样品分散在和自身折射率差异明显的液体中来实现。许多有机固态物质的折射率在1.50-1.70之间。硅油折射率只有1.40，并且几乎是化学惰性的，是一种理性载体。其他可用来分散的液体包括矿物油、水、浸镜油等。一条基本原则就是，被分散样品不溶于分散液体。对于一个粉末样品来说样本的常规制备方法如下：
1）在干净的载玻片上滴加一滴或数滴选地的分散液（对于含有较大颗粒的样品需要稍多的分散液来填充载玻片和盖玻片之间的空隙）。
2）采用微型取样器往载玻片上进行上样，并采用圆周或之字形运动的方式使样品在分散液中分散均匀，注意分散过程不用破坏样品形态，不要有气泡产生。
3）覆盖盖玻片，覆盖时以尽量小的角度开始，以尽量避免产生气泡。盖玻片和载玻片之间要充满分散液，一面样品随分散液在空隙间移动影响观察。同时采用擦镜纸或滤纸拭去盖玻片周围边缘多于的分散液，以免污染镜头和载物台。
采用偏光显微镜进行观察
采用偏光显微镜往往能获取晶型物质光学性质方面最有价值的信息。不论是药品、矿物、炸药、农药、颜料或陶瓷，每种晶型物质都用可用来识别它们的特征光学性质。采用偏光显微镜，无需其他辅助设备即可实轻松实现在不同条件下对样品进行观测。这些不同的条件包括：非偏振光、平面偏振光、圆偏振光、正交起偏器、非正交起偏器。下文会以实际应用对它们进行介绍。
振动方向和传播方向在各个方向均垂直的光是非偏振光。一般来讲，这种非偏振光除了可观测粒径和性状之外，对晶型物质而言没有更多地用处。当非偏振光遇到偏光过滤器时，只有振动方向平行于过滤器光栅的光可以通过而成为平面偏振光（plane polarized light）。当平面偏振光直接抵达检偏器（与起偏器成90°角）时，没有光线可以通过，视野内黑暗。该种条件称之为正交起偏器（crossed polarizers）。
图2 偏振光光路示意图
由于平面偏振光的振动方向是已知的，因此只需转动载物台即可对单晶进行不同方向的观察。平面偏振光有以下两个主要应用：
Ø 通过偏振光的方向对各向异性的晶体化合物定位进而测定其折射率。如果采用非偏振光测定折射率则测得的为各个方向折射率的平均值。对于各向同性的晶体来讲，没必要采用平面偏振光，因为其折射率与方向无关。
Ø 确定各向异性晶体化合物在特定振动方向的吸收颜色。当彩色的晶体化合物在平面偏振光的照射下进行旋转时，其色彩或色彩的强度或出现变化称之为二色性或多色性。当采用非平面偏振光进行观察时色彩会是各个方向的平均化。
对于各向同性的晶体而言（在一定的温度和波长下），光线在各个方向以相同的速度通过，因此各向同性的晶体只有一个折射率。其他各向异性的晶体化合物则有两只三个折射率。当偏振光进入各向异性的化合物后，根据传播速度的不同会在快慢两个方向分解为互相垂直的两个振动波。当两个方向光波均透过化合物时，慢方向的传播是相对滞后的。一种便捷说明不同方向折射率的方法是构建被称为折射率椭球体（indicatrix）的三维模型。折射率以半径的形式展示出来，其长度与折射率大小成正比。对于各向同性的物质而言其折射率椭球体是圆形（图3，a），因为各个方向的折射率都一样，唯一可变的是大小，随折射率的不同而不同。
对于有两个折射率的物质其折射率椭球体为旋转椭球体。三方晶系、四方晶系和六方晶系均具有常规和非常规两个光线轴，相应折射率分别为nω和nε。两个光线轴方向任何一个均有可能是快或慢的传播方向。常规波的振动方向与晶体的光轴平行，表现为各向同性，传播方向呈球形具有圆形的切面（C）。非常规波振动方向与C切面垂直。两种波综合的结果就是折射率椭球体呈椭圆球形（图3，b）。唯一的光轴是垂直于C切面的OA，像这种只有一条光轴的晶体被称为单轴晶体（uniaxial）。
单斜晶体、三斜晶体、斜方晶体具有三个互相垂直的光线轴，相应折射率分别为α、β、γ，α数值最小（传播最快），γ数值最大，传播最慢。其折射率椭球体为有三轴椭球体（图3，c）。在该三轴椭球体内有两个交叉的圆形横切面C’和C’’，均以β折射率大小为半径，每个横切面有与其垂直的光轴A’和A’’，两个光轴所在的平面被称为光轴面（optic axial plane），该平面同时也是α和γ所对应光线轴所在平面。像这种具有两条光轴的晶体被称为双轴晶体（biaxial.）。
两条光轴间的锐夹角被称为光轴角（optic axial angle，2V），与折射率有关，对相应的化合物来讲是常数。对于单轴晶体和双轴晶体而言，其光轴和光线轴存在一定的对应关系。比如对于三方晶系、四方晶系和六方晶系，其光轴和光线轴是重合的，对于正交晶系来说任意光轴可以和任意光线轴重合，对于三斜晶系任意光轴和光线轴均不重合。
图3 不同类型折射率椭球体示意图
当采用平面偏振光时，如果未放置样品或放置各向同性的晶体样品时视野内是黑暗的，对于各向异性的晶体除非从光轴方向观察或样品刚好处于消光位置，则样品由于双折射现象视野会是明亮的。当采用非偏振光时，则可同时观察到各向同性和各向异性的样品，对于各向异性的样品同样可观察到干涉色和消光位置，但此时观察结果和采用正交偏振光观察的结果并不一致，因此非正交偏振光只用来观察混合样品，而一般不用来对晶体物质进行光学性质测定。
干涉光（Interference Colors） 采用正交偏振光可观察到干涉色或偏振色（polarization colors）的是由于光线在各向异性晶体中传播过程中一个方向的传播滞后于另一方向，当两个方向均穿过晶体后再次在检偏器中重合这一对光的解构和重构过程造成的。干涉色被分为不同的色阶，一般见于边缘的斜面。低色阶干涉色经常在较薄的边缘观察到，随着晶体厚度增加色阶向高阶移动。如图4为一水乳糖偏振光图片，中心为五阶的绿色，边缘可观察到二阶的红色。晶体中色带随晶体厚度的变化类似地图中的等高线，色带越接近说明晶体表面越“陡峭”。
图4 一水乳糖偏振光干涉色图片
晶体的干涉色除了与厚度有关外还与观察晶体的方向有关，如图5所示，对于方向随机分布的化合物而言可能会观察到一系列不同的干涉色，因此仅仅依靠干涉色并不能对不同晶体进行区分。
图5 某晶型化合物偏振光图片
消光（Extinction） 采用正交偏振光观察具有双折射的晶体时，由于消光现象载物台每旋转90°视野均会变黑暗一次，消光发生时，晶体内光线振动方向和起偏器或检偏器的方向一致（光活性物质除外）。消光角是以目镜中的十字线为基准的，此时十字线的位置必须与起偏器和检偏器严格一致。当消光位置和晶体性状的关系确定以后，便可以作为特定晶系的一种象征。
如图6-a所示，当消光发生在晶体较长的一边以十字线平行时，此时消光位置为直线光（straight extinction）；如6-b所示，消光位置与十字线成一定角度时称为斜消光（inclined or oblique extinction），表示消光角时一般不超过45°；如下图6-c所示，当消光位置发生在十字线平分两个毗邻晶面的夹角时，此时为对称消光（symmetrical extinction）；如6-d所示，当波状消光（Undulose extinction）发生时随着载物台的转动在晶体表面可见到黑色区域移动，一般发生在弯曲或者张力较大的晶体中。
图6 不同类型消光示意图
此外有些晶体并不完全呈现消光现象，而是会发生干涉色的转变，被称为异常消光（dispersed or anomalous extinction）。出现这种现象的原因是不同干涉色的消光位置不同所致。当晶体具有干涉色但没有消光位置时，此时晶体可能为多晶体，当在较大倍数进行观察时可见在任何时候都有许多晶体处在不同的消光位置；也可能为孪晶，当一个晶面消光时，另一个晶面不消光。
折射率
样品的折射率会严重影响样品的可观察性，也可用来对物质进行鉴别，是物质最重要的光学性质之一。物质可可观察性可通过增加分散液和样品间的折射率差异来改善。折射率是光在真空中传播速度与光在物质中传播速度的比值，总是大于1。对任何物质而言，折射率是常数，只与波长和温度有关。折射率越大，传播速度越慢。用于不止一个折射率的物质被称为双折射。双折射指各向异性的物质最大和最小折射率的数值差。例如，碳酸钙晶体两个折射率分别为1.658/1.486，其双折射为0.172。对于各向同性的物质而言不存在双折射。一种物质的折射率是由其原子和分子的结果决定的。如果一种物质用于较大的双折射，即使不知道其晶体结构也可能对其分子的堆积方式进行预测。当预测的结果和显微镜观察的晶体性状（比如针状。）吻合时则更加有意义。比如，平面状分子倾向于彼此平行排列而使晶体成针状，而伸长的分子则倾向于依次排列而使晶体成层状。
可通过浸没法测量样品的折射率。将待测样品浸没在已知折射率的液体中，当待测样品折射率与浸润的液体差异很大是，样品是清晰可见的，随着折射率的减小，当样品和浸润液体折射率相同时样品变得不可见，此时浸润液的折射率就是样品的折射率。大部分商业化的浸润液是有机试剂，存在将样品溶解的风险。如果溶解过程较缓慢，则测得的折射率与实际值是比较接近的。如果溶解较快则需对浸润液进行预饱和，然后采用折光仪测得饱和溶液的折射率后，再对样品折射率进行检测。
许多方法可以用来确定何时样品和浸润液的折射率是相同的。这些方法中最常用的是Becke test。该方法简便易行，可以区分0.001的折射率差异。Becke test是通过对比样品和浸润液的折射率的大小来进行的。如果采用的是非偏振光，对于各向异性的物质测得的是平均折射率。
Becke test是通过样品和浸润液边缘的明亮光晕（称之为Becke line）来进行的。随着对样品进行上下调焦，Becke line会穿过样品和浸润液边缘的界面来回运动。进行Becke tes一条简单的准则就是“由下到上”或“由低到高”。在目镜和样本距离变小的过程中（往上移动载物台），Becke line会由折射率大的一侧往小的一侧移动，反之亦然。如图7所示，该图中，分散液折射率大于样本折射率。当样品和浸润液折射率相同时Becke line消失。
图7 Becke test示意图
粒径
光学显微镜可以有效测定1-400μm范围的颗粒（粉末）的粒径。但如果想准确检测小于5μm的粉末的粒径则建议采用扫描电镜。当在目镜中配备量尺（measuring scale）就可以对观测到的颗粒进行测量，但量尺必须是经过校准的。对于球型颗粒而言（制药中较少遇见），仅直径就足以描述其大小，对于非球型的颗粒而言，许多统计学粒径也被用来描述其大小，如Feret径、Martin径及投影径等。当比较不同样品间颗粒的大小时，并没有必要每次都进行精确粒度分布检测。也可采用光学显微镜进行快速的分析。通过对制备好的样品不同大小的颗粒进行观察可以得出平均粒径。虽然该方法不够精确，但方便快捷，对于区分粒径差异较大样品已经足够。
颗粒形状
晶体物质的外观或晶癖是尤其内部的分子结构所决定的。目前晶体学中以有许多属于专门用来描述七种晶系中存在的各种晶癖。在常规的显微观察中晶体晶癖的鉴别是不现实或不必要的（如正交晶系、复六方双锥晶组、锲形晶组等），特别是在晶型外观不同仅仅是由于在生长过程中晶面的不均匀形成导致的时候。但当采用更简明易懂的方式描述晶癖时，是非常适合用来检测晶体化合物批次间差异的。此外，晶癖对药物的可压片性及溶出等均有较大影响。
有六种晶体形状被识别出来，并且它们会出现在七种晶系中的任何一种里面。USP也采用了这些属于对晶体形状进行描述，以下将会分别描述，示意图如图8所示。
图8 不同晶体性状示意图
在描述晶体形状时必须小心使用六边形、立方形、菱形等字眼，因为这些专属性较强的描述，当使用它们时便意味着对它们所属晶系有足够的认知。相反，使用类似六边形的、立方形的、菱形的及岩状的这类描述更适合并且可提供足够的信息。有时晶体也会呈现比较特别的性状有时是几何状，如方形或菱形的，因此也可以将晶体描述为：似方形、矩形或菱形的板状晶体、似三角形的薄片状晶体或点状的片状状晶体等不一而足。在粉末状晶体物质中，根据不同晶面的生长速度可能会呈现一系列不同形状。在大量呈现似六边形的板状晶体中也会部分呈现似三角形或菱形。经过粉碎或研磨的粉末已不再能提供最初晶体外观的任何信息。
除了上面对晶体性状的描述采用下面这些术语描述晶体外观可以提供更全面丰富的信息。
有角度的（Angular:）：边缘或拐角有一定性状（如在破碎的晶体片段中）
圆润的（Rounded）：边缘或拐角没有可辨识的性状
不规则的（Irregular）：不成形的，缺乏可辨识的几何形状
颗粒状的（Granular）：形状不规则但整体是等径的
自行晶（Euhedral）：晶体呈现出自身完整的晶面
它形晶（Anhedral）：晶体，但没有自己的晶面
多晶型（Polycrystalline）：多种进行紧密混合
隐晶（Cryptocrystalline）：无法采用光学显微判断的多晶型物质，但有XRD衍射图像
透明的（Transparent:）：一般比较干净、但可能会有裂痕或包合物
半透明的（Translucent）：由于含有细小裂痕或是多晶型物，大部分比较朦胧
不透明（Opaque）：由于光散射或晶体折射率极高而不透光
有色泽的（Colored:）：有特征的颜色
薄层状（Lamellar）：板状堆叠而成（见图9）
叶片状（Foliated）：叶形片状晶体堆叠而成（见图9）
球晶（Spherulitic）：内部有针状组成的球状晶体
图9 不同晶体颗粒外观示意图
比较粉末样品
在对样品进行观测时最好拍摄图谱以便比较不同批次间样品的差异，这些不同可能包括粒子外观及粒径等，如果都是在相同倍数下观测的这种比较会更加方便。同时最好有相关简短的描述。对样品的观察报告中应包括但不限于一下内容：
晶体的性状
晶体的粒径范围和平均粒径
描述晶体间的相互关系（分布情况）
有关结晶度的任何信息（是否有双折射等）
显微图像（含有比例尺和方大倍数）
分散介质
显微镜型号
一个采用显微镜观察天冬氨酸的实例如下，图片如图10所示。样品为由针状、板条状、板状及棱柱状无色粉末组成的混合物。针状、板条状及棱柱状粒子长度在50-600μm范围（大部分150μm左右），这些粒子长宽比在2:1至15:1不等。当采用偏振光进行观察时，粒子有明亮的干涉光，每旋转90度消失一次，说明为晶体物质。样品粉末采用硅油分散，采用尼康Optiphot POL显微镜观察。
图10 天冬氨酸显微镜图片
热台显微镜
热台显微镜可以通过在载物台上放置热台对样品加热（冷却）时进行观察，示意图如下。作为一种分析手段，热台显微镜可以用来观察热力学引起的一系列现象，如融化、结晶、升华、去溶剂化、相变及热致性结晶等。此外由于可通过其对热力学相图进行快速分析，在一定程度上也可与DSC、DTA、TGA等热分析手段相互弥补。
图11 偏光显微镜加热台示意图
显微镜作为微型实验室
偏光显微镜除可以用来观察和表征晶体化合物外，还可用来观察晶体的生长。此外还可以观察到溶液介导的晶型转变。一个用来说明溶液机制相变和固体机制导极好的例子就是硝酸钾。当在载玻片上滴加一滴略微不饱和硝酸钾溶液（不加载盖玻片，是液体在室温可缓慢挥发），随着液体挥发会首先在液滴边缘看到菱面状的亚稳β晶体出现（图12-1）。过较短时间后，会观察到室温稳定的高度双折射的板状α晶体的出现。随着α晶体的生长，会发生溶液机制的相变导致与α晶体生长方向临近的β晶体溶解（图12-2），当α晶体生长过程中接触到残余的β晶体时，会同时再发生固相机制的相变，最终液滴内的晶体会全部转变为α晶体。
图12 硝酸钾晶型转变过程显微镜图片
多色性
许多有机和无机化合物都是有颜色的，并且有时可根据颜色的不同区分不同的晶型。例如碘化汞，在室温下为四方晶系，稳定的相态为红色而亚稳的相态则呈现橙色，在温度高于127℃时，其稳定的相态则变为黄色的正交晶系。红色和黄色相态的转变是可逆的，这一过程使用偏光显微镜肉眼即可观察到。这种不同晶型具有不同颜色的现象被称为“色彩多晶型（color polymorphism）”。产生这种现象的原因是不同晶型之间构象的差异。当采用白色平面偏振光观察透明的有色晶体时，随着载物台的旋转晶体的颜色或色彩的强度往往会发生变化。产生这种变化的原因是晶体物质对特定振动方向上光的选择吸收。
无色或各向同性的晶体化合物一般不会呈现多色性，此外，有些有色泽的晶体化合物如果各个方向吸收比较接近也不会呈现多色性。但当一个高双折射的无色晶体分散在液体中并且液体的折射率与晶体的某一个主折射率接近时，当在平面偏振光下旋转观察时则可能会出现多色性。有时晶体的色彩也可能是由晶体内部会表面的有色杂质所引起的。具有多色性的有机化合物一般含有发色团（偶氮基、共轭乙烯基等），当光振动方向与发色团方向一致时，对光的吸收最强。因此在没有缺少XRD数据的情况下，如果化合物观察到多色性，也能为化合物分子的排列和堆积提供有用的信息。
晶体机械性质
在药用化合物开发初期阶段，由于样品较少，往往只能采用纳米压痕仪对硬度、弹黏性、塑性及脆性等机械性质进行检测。但通过光学显微镜也可以对物质进行定性的分析，如物质是是发生塑性形变还是脆性破碎、物性是软还是硬等。只需将少量样品（微克级别）放在载玻片上，加载盖玻片后，轻轻按压或做相对运动，随后将其置于显微镜下观察，对于硬的脆性破碎的样品，会呈现粉尘状的碎末，而软的塑性形变的样品则会被拉伸或呈现粘性甚至会在上下玻片上留下痕迹。
图 13 不同机械性质样品显微镜图片
假晶型
晶体化合物经历物理或化学变化（如其溶剂化或相变）时其晶体外观可能会发生改变，这是由于晶体内部结构的改变导致的，有时由于体积的显著变化甚至会导致晶体的解构。但有时这种变化也可以是非解构性的：晶体内部结构发生了变化但其外观没有变化，这种现象被称为假晶型（pseudomorph）。许多水合物或溶剂化物有在空气中加热时会失去相应的结晶水会溶剂，由于密度或排列方式的改变此时晶体可能会变为多晶型，而且通过透射光进行观察时往往是朦胧或不透光的。二水合草酸便是一个例子。在60℃以上加热时，由于失水其由无色（白色）的水合物变为不透光的无水物。
图14 二水合草酸失水前后显微镜图片
结语
Look at your samples!
译者注：
本文节选自Polymorphism in the Pharmaceutical Industry一书Light Microscopy章节
来源：药事纵横迎风而立
