本文主要介绍了厦门致善生物科技股份有限公司研发的医疗器械“分枝杆菌鉴定试剂盒（荧光PCR熔解曲线法）”的临床前研发实验。

一、分枝杆菌鉴定试剂盒（荧光PCR熔解曲线法）产品的主要组成成分 

本试剂盒含有分枝杆菌PCR反应管、分枝杆菌阳性对照、分枝杆菌阴性对照、PCR八联管管盖，主要组成成分见表1。

表 1 试剂盒主要组成成分

二、分枝杆菌鉴定试剂盒（荧光PCR熔解曲线法）的产品预期用途 

本产品用于体外定性检测分枝杆菌培养物样本中的19种分枝杆菌核酸，包括：结核分枝杆菌（复合群）、耻垢分枝杆菌、牛分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、龟分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、缓黄分枝杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、偶然分枝杆菌、海分枝杆菌或溃疡分枝杆菌、土地分枝杆菌、不产色分枝杆菌、苏加分枝杆菌、马尔摩分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌。

本产品适用于临床上分枝杆菌感染的辅助诊断。 

三、分枝杆菌鉴定试剂盒（荧光PCR熔解曲线法）的产品包装规格

48测试/盒。 

四、分枝杆菌鉴定试剂盒（荧光PCR熔解曲线法）的产品检验原理

本试剂盒采用荧光 PCR 熔解曲线法，根据不同分枝杆菌ITS片段的特异序列设计探针，采用特定的荧光通道和熔点进行分枝杆菌的鉴别。同时在体系中加入外源性内控模板（拟南芥管家基因SUC2作为参照基因），对扩增体系进行质量控制。

五、分枝杆菌鉴定试剂盒（荧光PCR熔解曲线法）的主要原材料

本产品主要原材料包括：引物、探针、聚合酶、UNG酶、dNTPs、质粒原料等。主要原材料聚合酶和质粒原料为自产，其他原材料均为外购。引物、探针为申请人自行设计后由专业合成公司合成。申请人选择有资质的供应商提供的原料，通过功能性试验，筛选出最佳原材料和供应商，制定了各主要原材料的质量标准并经检验合格。 

企业参考品设置情况：申请人设计了完整的企业参考品，包括阳性参考品、阴性参考品、检测限参考品和重复性参考品等，均采用真实样本灭活后制备而成。阳性参考品来源于30份检测范围内分枝杆菌样本制备而成，阴性参考品来源于25份检测范围外分枝杆菌样本或不含分枝杆菌样本制备而成，检测限参考品来源于5份检测范围内分枝杆菌样本制备而成，重复性参考品来源于5份检测范围内分枝杆菌样本制备而成。

申请人通过对试剂主要生产工艺的研究，确定了最佳生产工艺。申请人对反应体系中引物、探针、聚合酶、UNG酶和dNTPs等的浓度和用量进行了优化，并对反应体系的扩增程序、退火温度、退火时间、扩增循环数、样本用量等进行了优化和验证，此外对样本核酸的提取方法和取样量进行了验证，通过验证最终确定了最佳反应体系。 

七、分枝杆菌鉴定试剂盒（荧光PCR熔解曲线法）的分析性能评估研究

该产品分析性能主要包括：核酸提取性能、阴阳性符合率、精密度、最低检测限、特异性（交叉反应、干扰试验）、包容性研究等。申请人提交了有效运行的质量管理体系下生产的不少于三批的产品在适用机型SLAN-96S全自动医用PCR分析系统上的性能评估资料。

在核酸提取性能研究中，比较评估了产品配套使用的核酸提取试剂盒的提取效果，结果表明配套使用的核酸提取试剂盒的核酸提取性能满足产品使用需求。

在阴阳性符合率研究中，申请人采用不少于三批的成品试剂盒，检测企业阳性参考品、阴性参考品和临床样本。结果表明阳性符合率和阴性符合率均为100%。

在精密度研究中，申请人采用不少于三批的成品试剂盒，对两种不同浓度的 19 份阳性样本和 4 份阴性样本，进行了多天的精密度研究，评估了试剂盒批内/批间、日内/日间、不同操作者之间等的精密度。结果表明：试剂盒批内/批间、日内/日间、不同操作者之间的精密度均符合要求。

在最低检测限研究中，申请人采用不少于三批的成品试剂盒，检测19种分枝杆菌的系列浓度梯度样本，将达到100%阳性检出率的最低浓度水平作为确定的最低检测限，并进行最低检测限验证。最终确定该产品最低检测限为 103菌/mL。

在交叉反应研究中，申请人采用不少于三批的成品试剂盒，进行了近源菌及不在试剂盒检测范围中的呼吸道感染相关病原体等的交叉反应。结果表明：本试剂盒与亚洲分枝杆菌、胃分枝杆菌、施氏分枝杆菌、次要分枝杆菌、产鼻疽分枝杆菌、草分枝杆菌、抗热分枝杆菌、金色分枝杆菌、微黄分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、科莫斯分枝杆菌、新金色分枝杆菌、副偶然分枝杆菌、猪分枝杆菌、灰尘分枝杆菌、塞内加尔分枝杆菌、田野分枝杆菌、南非分枝杆菌、迪氏分枝杆菌、母牛分枝杆菌、肺炎球菌、嗜肺军团菌、百日咳博德特氏菌、巴西诺卡氏菌、北京棒杆菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、隐球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌、人流感病毒A型、人流感病毒B型、人副流感病毒1型、人副流感病毒2型、人副流感病毒3型无交叉反应。

在干扰试验研究中，申请人采用不少于三批的成品试剂盒，对样本中可能含有的干扰物质进行了研究，包括常见的外源干扰物质利福平（9 mg/L）、异烟肼（12 mg/L）、乙胺丁醇（8 mg/L）、吡嗪酰胺（45 mg/L）、卡那霉素（30 mg/L）、链霉素（50 mg/L）、阿莫西林（11 mg/L）、扎那米韦（0.5 mg/L）、肾上腺素（1 mg/L）、地塞米松（20 mg/L）、莫匹罗星（20 mg/L）药物等，结果显示相应干扰物质不会对产品的检测结果产生干扰。

在包容性研究中，申请人采用三批成品试剂盒，对标准菌株及收集于不同地区的不同来源的各目标菌的阳性样本进行检测。包括：结核分枝杆菌（含 H37RV 菌株）、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、牛分枝杆菌（含 ATCC35743 菌株和 BCG 菌株）、耻垢分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、龟分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、缓黄分枝杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、偶然分枝杆菌、海分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、土地分枝杆菌、不产色分枝杆菌、苏加分枝杆菌、马尔摩分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌。检测结果表明，本试剂检测不同地区收集的上述不同种类分枝杆菌均能检出。

八、分枝杆菌鉴定试剂盒（荧光PCR熔解曲线法）的阳性判断值研究

申请人采用该产品和配套仪器对收集的临床样本进行检测，获得原始的 Tm 值，通过对相应样本的数据分布进行统计分析并计算标准偏差制定各指标的参考区间。采用多例样本进行参考区间的验证，根据验证结果最终确定了试剂盒的参考区间。

九、分枝杆菌鉴定试剂盒（荧光PCR熔解曲线法）的稳定性研究

申请人对本产品的实时稳定性、开封稳定性、冻融稳定性、运输稳定性以及样本稳定性等进行了系统的研究，确定了在各种条件下本产品及样本的有效保存时间。

实时稳定性：试剂盒分别储存于 2～8℃和-20±5℃温度下，在不同时间点对试剂盒的外观、最低检测限、特异性和精密度等性能进行考察。结果表明试剂盒在-25～8℃避光保存，有效期 18 个月。