免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)技术是利用抗原抗体特异性结合原理建立的技术，利用带显色剂的抗体原位特异性的标记组织中的抗原，并利用组织化学的显色技术，对相应抗原进行定性、定量和定位的技术，广泛的应用于基础研究和临床病理诊断。

免疫组织化学技术所需组织切片可以采用石蜡切片、冰冻切片及细胞涂片，其中石蜡切片保存结构较为清晰，但在制备过程中容易损伤抗原；冰冻切片可以较好的保存组织中的抗原，但是切片的清晰度较差。

本文以石蜡切片为例介绍免疫组化技术流程：

一、固定

固定的作用在于保存组织形态结构和内部抗原。常用的固定液是4%多聚甲醛，固定方式以浸泡式固定，固定时间通常为24小时，对于植物组织可以采用抽真空的方式，辅助固定液的渗透。取材部位需准确，不宜过大，过大的组织不易固定，且在后续实验中会因为渗透不良而造成组织破碎。

具体操作：选取观测目标位置，用双面刀片切取2mm左右的组织，于固定液中浸泡固定24h。固定完成后于4℃冰箱保存，待不同处理全部取样完毕后进行后续实验。

二、脱水

脱水的目的在于脱去组织中的水分，便于石蜡的渗透。石蜡无法与水互溶，水分的存在会造成石蜡渗透不良破碎。

配置梯度乙醇，吸弃原有溶液后，依此加入50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇，每级脱水30min，其中100%乙醇脱水两次。

三、组织透明

组织透明是利用二甲苯将组织中的乙醇置换出来，便于后续石蜡渗透。透明时间通常为60min，也可以根据你组织大小和类别进行调整，直至组织呈现透明状态为宜。

吸弃乙醇，加入二甲苯，于室温中透明60min两次，较大的组织透明3次。

四、浸蜡和包埋

将石蜡和二甲苯按比例混合后进行浸透。采用1:3、1:1、3:1二甲苯：石蜡的混合液进行依此浸透，每次浸透2h，最后再采用纯石蜡浸透2-3次，每次2-4h。

包埋时，先在包埋模具中注入融化的石蜡，将浸蜡完全的组织调整好方向置于包埋模具中，凝固后脱模。

五、切片

将蜡块按照切片的方向进行塑形后固定到切片机上，切片厚度在4-10um，分辨出需求较高，可以降低切片厚度。切下的组织在35-45℃的温水中进行展片，若要提高切片的平整度可以在水中加入2-5%的乙醇。捞起的切片在40℃烘箱中烘干后进行后续实验。

六、抗原修复

抗原修复的目的在于暴露细胞内的抗原决定簇，常用热处理法，将切片在柠檬酸缓冲液中，微波炉高火加热5分钟取出冷却后再加热，共加热3-4次。抗原修复前先对切片进行脱蜡和复水，保证抗体与组织内的抗原可以充分结合。

二甲苯脱蜡10min*2次

梯度乙醇复水：100%*2、95%、80%、70%乙醇各5min

ddH2o：清洗3min*3次

PBS：3min*3次

七、内源性过氧化物酶消除

组织中存在内源性过氧化物酶，可以与DAB结合显色，造成假阳性结果，采用H2O2与内源性过氧化物酶反应进行消除。具体做法：3%H2O2孵育10min，PBS清洗3次，每次3min。

八、血清封闭、抗体孵育

采用与二抗同源的血清进行封闭处理，防止非特异性结合；根据实验目的选择合适的抗体，特异性的识别目的蛋白，初次实验，可以稀释不同的抗体浓度，优化最佳的抗体浓度，如1：250，1:500，1:1000。

血清封闭1h，弃去血清后加一抗孵育，室温孵育1h后转入4℃孵育过夜。

九、显色、复染、封片

抗原抗体复合物没有颜色，需要借助化学基团的显色作用才能在显微镜下进行观察。常用的试剂为3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB），在HRP的催化作用下，H2O2将DAB氧化成还原型的DAB，呈现棕色不溶性沉淀。

为了突出细胞轮廓，便于目标蛋白定位，通常采用苏木素进行复染，染色后清洗5min，置于氨水中返蓝5min，在进行依次脱水、透明、封片：

DAB室温孵育3min-清洗3min-苏木素染色1min-清洗5min-氨水返蓝5min-50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、100%二甲苯，每级脱水2min，其中100%乙醇脱水和100%二甲苯透明各两次；

中性树胶封片进行镜检。