彗星电泳实验，又称为单细胞凝胶电泳试验（Single Cell Gel Electrophoresis，SCGE），是一种用于检测DNA损伤的实验技术，可在单个细胞水平上进行。这种方法能够有效评估DNA损伤的程度，包括由受试物直接引起的DNA链断裂、碱性不稳定性位点导致的DNA链断裂，以及DNA切割修复过程中引起的瞬时DNA链断裂，是一种常用的DNA损伤评估方法。

实验原理：

彗星电泳实验基于凝胶电泳技术，通过在电场中将DNA或其他生物分子移动到凝胶中，利用分子大小和电荷差异产生的不同迁移速度分离这些分子。样品加载到凝胶中后，在电场作用下，带负电荷的分子会向阳极移动，而带正电荷的分子则向阴极移动，形成不同长度的带状图案。这些带状图案中，尾部呈现延伸状，类似彗星，故得名彗星电泳。通过观察这些带状图案，可以评估DNA损伤与修复、细胞凋亡等生物学过程，是一项重要的生物分析技术。

实验步骤：

1、准备细胞：将细胞铺于六孔板中，待其生长到80%-90%的密度，收集细胞并进行计数，然后使用PBS缓冲液将其稀释至每毫升含有100个细胞。

2、玻片（载玻片）制备：使用PBS缓冲液分别制备20毫升含有0.5%正常熔点琼脂糖（NMPA）和0.5%低熔点琼脂糖（LMPA）的溶液。

3、第一层胶制备：将载玻片浸入煮沸的正常熔点琼脂糖溶液中，可使用小烧杯。将其取出后，擦拭去背面的琼脂糖，然后放入60摄氏度烤箱中过夜，随后在室温下保存。

4、第二层胶制备：将准备好的0.5%低熔点琼脂糖溶液放入37摄氏度的水浴锅中备用。取100微升该溶液，并加入10微升细胞悬液（约含有1000个细胞）。充分混合后，滴在第一层胶上，并盖上新的载玻片，用力压平。将其放置在4摄氏度下1-3分钟以固化。需注意，固化时间过长会导致胶变干，使得盖玻片与胶结合紧密，难以取下盖玻片，同时易造成胶一同被扯下。

5、裂解细胞：将玻片缓慢浸入新鲜配制的冰冷细胞裂解液中，保持在4摄氏度条件下裂解2小时。

6、碱化处理及电泳：将玻片取出，置于水平电泳槽中（正极端），并排放置，确保无空隙。倒入新鲜配制的冰冷电泳缓冲应用液，使其高出胶面2毫米，避免气泡存在。放置10至30分钟，通常选用15分钟，以使DNA解链。设定电压为25V，电流为300mA，进行20分钟的电泳。

7、中和：切断电源，取出玻片并置于染缸中，用中和缓冲液（Tris-HCl）浸洗，每次5分钟，共重复3次。

8、染色：在中和后，将玻片晾干至中性状态。然后使用20ul至50μl的PI应用液进行染色，并盖上新的盖玻片。除了中和和染色步骤外，其余各步应在暗处进行，以避免额外的DNA损伤。

9、镜检：染色后的DNA样品应尽快在荧光显微镜下进行观察。未受损的细胞表现为圆形荧光核心，即彗星头部，没有尾巴。而受损的细胞则呈现出彗尾朝向阳极的形态，形成明亮的头部和尾部。

注意事项：

（1）第7步如果不立即观察，可以在中和后不染色，将玻片放入无水乙醇的染缸中浸泡15分钟，然后捞出晾干并避光保存，需要时再染色。这样处理后的玻片可保存三个月。但如果需要进行脱水处理，则应选择透明底的玻片，因为磨砂玻片表面不平整，在酒精脱水后凝胶会形成颗粒，影响读片质量。

（2）在制备凝胶时，必须防止脱胶现象的发生，为脱胶会导致凝胶结构的破坏，进而影响其完整性和稳定性，从而影响实验结果的准确性和可重复性。

（3）如果 DNA 损伤严重，则产生的碎片就越多、越小，向阳极迁移的DNA碎片量就越多，迁移距离也越长，荧光染色后就能看见“彗星”样尾长并且荧光强度增强。未受损伤的 DNA 大分子则由于细胞膜的阻隔，滞留在原处。

如图所示为M059K细胞彗星结果：