摘 要： 建立了基于钝化碳量子点的荧光分光光度法测定护肤品中的谷胱甘肽含量。高温加热柠檬酸制备碳量子点溶液，将不同浓度的谷胱甘肽标准溶液与1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺溶液（EDC）混合10 min，加入碳量子点溶液中反应10 min。样品用水提取，经PBS磷酸盐缓冲溶液稀释后，与标准溶液进行同步操作，测定荧光强度。谷胱甘肽溶液的质量浓度在0.1～100 μg/mL范围内呈线性关系，相关系数为0.999 4，方法检出限为0.004%。在3种基质中，高、低两种加标水平下的平均回收率为93.7%～101.5%，测定结果的相对标准偏差为1.3%～3.3%（n=6）。该方法操作简便，适用于护肤品中谷胱甘肽含量的快速检测。

关键词： 荧光分光光度法； 护肤品； 谷胱甘肽

 

近年来，随着消费者对健康重视程度的提升以及对护肤品成分关注度的增加，市场上对于多样化、具有明确功效且见效迅速的护肤品需求日益增长，这一趋势也逐渐成为护肤品研发的核心方向［1］。肽类是当前广受关注的功能性成分。这类分子由蛋白质片段构成，通过脱水和聚合过程形成，并通过化学键（酰胺键）相互连接［2］。它们不仅具备调节生理状态和营养作用的能力，还对人体生长发育周期、营养物质代谢、免疫调节机制以及内分泌平衡等方面发挥着至关重要的作用［3-5］。其中，谷胱甘肽是最早被应用于护肤品的天然活性分子之一。它是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸三个氨基酸组成的三肽化合物，其结构内含特殊的活性基团，能够有效地清除身体内部自由基，从而起到抵抗氧化、改善皮肤颜色、淡化色斑及减缓衰老等功效［6-7］。

目前，谷胱甘肽的检测方法主要有液相色谱法［8-12］、液相色谱-串联质谱法［13-14］、毛细管电泳法［15-16］、电化学法［17-18］、荧光法［19-22］等，其中色谱、质谱技术和荧光法应用较为广泛。目前对护肤品中谷胱甘肽的检测大多用色谱、质谱技术，其方法灵敏度较高，但对设备的要求也高。荧光法因其简便的操作流程、低廉的仪器成本、快速的反应速度等优点，一直是科研和工业领域广泛关注的分析技术，但荧光法对谷胱甘肽的检测研究一般集中于生物样本（如血清等），应用于护肤品的检测还未见报道。研究［19］表明，高温加热柠檬酸得到的碳量子点通过1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）的钝化可提高其荧光强度。EDC分子被引入到碳量子点表面，促进了表面能级的陷阱发射，从而增强了碳量子点的荧光性能。通过预先将谷胱甘肽与EDC溶液混合，谷胱甘肽与EDC结合后消耗部分EDC，剩余的EDC继续参与钝化碳量子点，导致碳量子点的荧光强度发生改变。研究结果表明，谷胱甘肽的浓度与钝化后碳量子点的荧光强度之间存在一定的线性关系，从而实现对谷胱甘肽的检测。笔者结合护肤品的基质特点，首次应用该原理建立了荧光分光光度法测定护肤品中谷胱甘肽含量。该方法操作简便，检测成本低，为企业原料控制、保障消费者权益提供技术参考。

 

1. 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

荧光分光光度计：RF-6000型，日本岛津公司。

电子分析天平： BSA224S型，感量为0.1 mg，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

旋涡振荡器：Kylin-Bell VORTEX-5型，江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

高温炉：BF51866C-1型，美国赛默飞世尔科技公司。

pH计：PHS-3C型，上海仪电科学仪器股份有限公司。

高速离心机：3-18KS型，德国希格玛实验室离心机公司。

磁力搅拌器：MS7-H550-Pro型，大龙兴创实验仪器（北京）股份公司。

柠檬酸：分析纯，上海麦克林生化科技股份有限公司。

1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）：纯度（质量分数）为98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

PBS磷酸盐缓冲溶液：0.01 mol/L，pH=7.0，上海源叶生物科技有限公司。

氢氧化钠：分析纯，上海安谱实验科技股份有限公司。

EDC溶液：称取适量EDC，用PBS磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0）溶解，配制成质量浓度为50 mg/mL的EDC溶液。

谷胱甘肽（还原型）标准物质：纯度（质量分数）为99.9 %，上海安谱实验科技股份有限公司。

实验用水为一级水。

护肤品样品：市售。

1.2 实验步骤

1.2.1 碳量子点溶液的制备

称取2.00 g（精确至0.01 g）柠檬酸于15 mL的带盖小烧杯中，将小烧杯放置在180 ℃高温炉中加热。40 min后，柠檬酸由固体变成浅黄色的液体，将小烧杯从高温炉中取出，冷却至室温，此时小烧杯中的浅黄色液体凝固。向小烧杯中加入2 mL的100 mg/mL氢氧化钠溶液，在磁力搅拌下完全溶解，再转移至10 mL容量瓶中，用100 mg/mL氢氧化钠溶液定容，摇匀，得pH值为7的碳量子点溶液，待用。

1.2.2 溶液配制

称取谷胱甘肽标准物质50.0 mg于小烧杯中，加入PBS磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0）溶解并转移至50 mL容量瓶中定容，混匀，制备成质量浓度为1.0 mg/mL的标准储备溶液。准确移取适量体积的标准储备溶液至10 mL容量瓶中，用PBS磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0）稀释并定容，配制成质量浓度分别为0.1、0.5、1.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/mL系列标准工作溶液。

1.2.3 样品前处理

称取护肤品样品1.0 g（精确至0.001 g）于10 mL具塞比色管中，加入4 mL水和1 g氯化钠，在旋涡振荡器上旋涡振荡30 s，用水定容至标线，摇匀。4 000 r/min的条件下离心5 min。准确移取1.0 mL上清液至10 mL具塞比色管，用PBS磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0）定容至10 mL，摇匀，制备得样品溶液。

1.2.4 上机检测的前处理

准确移取5.0 mL PBS磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0）（对应F0）、5.0 mL不同浓度的标准工作溶液（对应F）、5.0 mL样品溶液，各加入50 μL EDC溶液（50 mg/mL），在旋涡振荡器上旋涡混匀10 min，各加入30 μL碳量子点溶液反应10 min，待测。

1.2.5 仪器工作条件

激发光波长为360 nm，激发与发射的狭缝宽度均为10 nm，扫描速度为2 000 nm/min，在380～600 nm的范围内扫描记录发射光谱。

1.2.6 标准曲线的建立

在1.2.5仪器工作条件下，记录1.2.4中各溶液在发射波长460 nm处的荧光强度，未加入标准溶液时体系的荧光强度为F0，加入标准工作溶液后体系的荧光强度为F。以谷胱甘肽的质量浓度为横坐标，F/F0为纵坐标，绘制标准工作曲线。

 

2. 结果与讨论

 

2.1 反应时间的选择

准确移取5.0 mL PBS磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0），加入50 μL的50 mg/mL EDC溶液混匀，再加入30 μL碳量子点溶液，记录不同反应时间的荧光强度见图1。由图1可知，前10 min内，荧光强度急剧升高；反应10 min后，体系的荧光强度基本平稳，说明EDC与碳量子点反应基本完成，所以选择10 min为反应时间。

图1   不同反应时间的荧光强度

Fig. 1   Effect of reaction time on fluorescence intensity

2.2 pH值的优化

考察不同pH值条件下对体系荧光强度的影响，结果见图2。由图2可知，当溶液pH值小于7时，荧光强度较小；当溶液pH值大于7时，荧光强度较大；在pH为7.0时，荧光强度最大，表明此时EDC对碳量子点的钝化作用最强，因此选择pH值为7.0为实验的反应环境。为减小pH值波动给实验带来的影响，选择pH值为7.0的PBS磷酸盐缓冲溶液作为配制谷胱甘肽和EDC的溶剂，同时在样品前处理时用pH值为7.0的PBS磷酸盐缓冲溶液作为稀释液。

图2   不同pH值下的荧光强度

Fig. 2   Fluorescence intensity at different pH values

2.3 共存物试验

考察护肤品中常见的共存物质L-赖氨酸、L-丝氨酸、L-肌肽、1，3-丙二醇、1，2-丙二醇、角鲨烷、苯氧乙醇、4-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸乙酯、4-羟基苯甲酸丙酯和4-羟基苯甲酸丁酯对谷胱甘肽测定结果的影响，用PBS磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0）将上述物质配制成质量浓度均为100 μg/mL的溶液，代替谷胱甘肽标准溶液按1.2.4和1.2.5步骤操作，不同共存物质下的F/F0值见图3。由图3可知，除谷胱甘肽之外，其他物质的F/F0值均接近1.0，表明只有谷胱甘肽能够消耗掉EDC，间接影响碳量子点的钝化程度，使碳量子点显示出不同的荧光强度，说明该方法对于护肤品中谷胱甘肽的测定有较强的特异性。

  1—空白；2—谷胱甘肽； 3—L-赖氨酸； 4—L-丝氨酸； 5—L-肌肽； 6—1，3-丙二醇； 7—1，2-丙二醇； 8—角鲨烷； 9—苯氧乙醇； 10—4-羟基苯甲酸甲酯； 11—4-羟基苯甲酸乙酯； 12—4-羟基苯甲酸丙酯； 13—4-羟基苯甲酸丁酯图3　不同共存物质下的F/F0值

Fig. 3   F/F0 values under different coexisting substances

2.4 线性方程、检出限和定量限

在1.2.5仪器工作条件下，按照1.2.6步骤建立标准工作曲线。体系加入不同浓度的谷胱甘肽后的荧光光谱图见图4。由图4可知，体系在发射波长460 nm处的荧光强度随谷胱甘肽浓度的增大逐渐减小，且最大发射峰位置相同，均位于460 nm，记录460 nm处的荧光强度F。

图4   体系检测不同浓度谷胱甘肽的荧光光谱图

Fig. 4   Fluorescence spectra of the system to detect different concentrations of glutathione

谷胱甘肽的质量浓度在0.1～100 μg/mL范围内与F/F0呈线性关系，以谷胱甘肽的质量浓度为横坐标（x）、F/F0为纵坐标（y）进行线性回归，计算得线性方程为F/F0 = -0.004 3x+0.969 8，线性相关系数为0.999 4。其中F为不同浓度的谷胱甘肽与 EDC溶液（50 mg/mL）预混合反应后加入碳量子点的荧光强度，F0为不含谷胱甘肽的体系荧光强度。连续测定11次不加入谷胱甘肽时体系在460 nm处的荧光强度，以3倍标准偏差与线性回归方程斜率的比值计算得检出限为0.4 μg/mL。由于方法在测试样品时称取1 g样品，经1.2.3前处理后，上机测试时相当于将样品稀释了100倍，因此方法检出限为0.004%，以3倍的方法检出限计算得方法定量限为0.012%。

2.5 加标回收试验

分别选取水剂、膏霜和乳液3种代表性样品进行回收率与精密度试验。称取不含谷胱甘肽的样品，分别添加高、低两个水平的标准溶液到样品中，分别做6次平行试验，回收率和测定值的相对标准偏差见表1。由表1可知，在三个浓度的加标水平下，谷胱甘肽的平均回收率为93.7%～101.5%，6次平行测定的相对标准偏差为1.3%～3.3%，表明该方法精密度、准确度均较高，可准确测定护肤品中的谷胱甘肽含量。

表1   阴性样品加标回收试验结果

Tab. 1   Negative sample spiking recovery test results

 

3. 结语

 

建立了基于钝化碳量子点的荧光分光光度法测定护肤品中的谷胱甘肽含量。该方法线性范围广，精密度和准确度良好，分析速度快，检测成本低，为护肤品中谷胱甘肽的检测提供有力的参考依据，可增强企业原材料的质量管理和控制，确保消费者的合法权益得到有效保护。

 

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