1. 色谱柱柱压 

2. 色谱峰峰形 

3 . 色谱峰保留值 

4 . 色谱柱柱寿命

1、柱压高多少正常？

同一条件：新色谱柱，C18，5µm，球形，4.6×250mm，100%甲醇，1mL/min，25℃，管路内径0.3mm（0.010″），通常:＜7MPa。

如果柱压高了，先确认出压力升高的组件，有可能是色谱柱也可能是其他组件的原因。色谱柱污染、填料堵塞、筛板堵塞都会造成压力升高。

2、确定压力升高来源？

保护柱-卸下保护柱，仪器堵塞-卸下色谱柱，色谱柱进口端堵塞-反方向测试（不是反冲！！）如果是色谱柱引起的柱压升高，问题是……

3、冲洗色谱柱

反相色谱柱（C18,C8）

按照以下方式冲洗：

a、 水/乙腈95/5→0/100 

b、

如果不行，可在异丙醇里加1%TFA。

使用己烷或二氯甲烷冲洗色谱柱，在重新使用反相流动相以前，必须用异丙醇过渡！正相色谱柱（SiO2.Diol），以下溶剂至少各50ml冲洗色谱柱:

原则：使用比MP更强的溶剂冲洗二氯甲烷>丙醇>四氢呋喃>乙醇>乙腈>甲醇>水。那么冲洗色谱柱  一定正确吗？

C18柱上蛋白的冲洗：  是DMSO而不是THF！！

C18柱上淀粉的冲洗：  是水而不是甲醇！！

根据强保留污染物性质，选择合适的冲洗溶剂和程序！！

4、冲洗筛板

强溶剂、反方向、低流速。

反相色谱柱：水/乙腈95/5→0/100

正相色谱柱：

50%甲醇＋50%三氯甲烷→ 100%乙酸乙酯

－冲洗筛板不要连接检测器

－不建议用户自行更换筛板

5、预防柱压过高

a、使用保护柱

b、样品前处理（重点讨论样品类型）

c、经常冲洗色谱柱

d、过滤流动相

e、缓冲液或水不要保存过长时间

6、样品基质如何去除 ？

制剂：淀粉、硅胶、其他添加剂

中药：强疏水性成分

常见以下几种情况：色谱峰拖尾、色谱峰分裂、色谱峰扩展，许多色谱峰峰形问题都是复合型问题， 造成色谱峰扩展和柱效降低；色谱峰扩展和拖尾或拖尾随保留加剧。从以下几个方面色谱柱问题、溶剂效应、进样量（过载）、样品的特性、柱外效应来分析。

1、色谱柱问题

污物在柱进口处积聚－强溶剂冲洗柱子

二次保留效应－加入扫尾剂,10mM的TEA

重金属污染－使用高纯硅胶基质色谱柱

对于难溶解的物质：小体积强溶剂溶解以后用MP稀释，扫尾剂：30mM的TEA（B性化合物），醋酸胺（A性化合物）

二次效应

不加TEA                  10mM的TEA

ASB C18,4.6×150mm，5µm，85% 25mM NaH2Na，15%ACN 1mL/min, 35℃

硅胶纯度

初始的硅胶基质，酸洗后的硅胶基质，流动相：20mM三甲胺

金属污染C18硅胶造成的碱性药物的拖尾

2、柱外效应

色谱柱：150×0.45mm, 硅胶柱

流动相：Hexane-CAN(99:1,V/V)

流    速：2.0mL/min

(a) 10µL进样阀与8µL检测器流，通池的商品色谱仪

(b) 0.5µL进样阀与1µL检测器流通池的商品色谱仪

柱外效应造成的色谱峰拖尾

3、溶剂效应

样品体积：30µL

流  动  相：18% 乙腈-H2O

分别以纯乙腈和流动相为溶剂注 入咖啡因（A峰）与水扬酸胺（B峰）样品

解决方法：

1、使用流动相溶解样品

2、加大浓度，降低进样量

样品溶剂进样的影响

4、样品特性

葡萄糖端基异构体的转化— 两个峰

提高温度，或提高pH值，转化加快 一个峰

色谱柱：Venusil HILIC 5µm 4.6×250mm；流动相：乙腈－水 (80: 20)；柱温：30℃ ；检测器：蒸发光散射检测器；样品：葡萄糖对照品水溶液，流速：1mL/min

5、柱外效应对峰形/分离度的影响

死体积是指从进样器到检测器的体积，这一段没有被色谱填料所填充的部分，死体积大，会导致峰展宽，峰形变差等等。

6、柱外效应对峰形/分离度的影响

尽量减小连接管路体积。尤其使用窄径柱时！

柱后和检测器之间标配一个两道，去掉后测试明显改善

7、柱外效应主要影响N值

进样量大主要引起柱子超载，保留时间和N值下降，一般凭经验找到是保留时间和N最大的进样量。一般：0.46mm的色谱柱最大进样量为10-50ug。一般开始时大样品量进样（10-50ug），然后逐渐降低进样量直至保留时间稳定。

8、色谱峰拖尾/扩展/分裂

色谱柱污染：复杂样品基体或待测样品量大

颗粒物堵塞筛板：复杂样品基体或待测样品量大

色谱柱死体积：流动相pH>7时，硅胶溶解(除非使用特殊色谱柱)，死体积增加。 

样品溶剂效应： 样品溶剂强于流动相-裂分峰和扩展峰取决于样品量

1、保留时间变化

漂移（单方向增加或减小 ）波动（无规律的变化）

2、保留时间变化原因

色谱柱平衡、固定相变化、色谱柱污染、流动相组成发生变化、疏水坍塌

3、色谱柱平衡

流动相变化（梯度洗脱的平衡）、温度变化、流速变化、更换色谱柱

至少使用10-20倍柱体积流动相平衡色谱柱

4、固定相变化

键合相流失：通常保留时间变短，使用耐酸色谱柱：venusil ASB C18和C8系列

硅胶溶解：裂峰，使用耐碱的色谱柱：Durashell C18 ，RP

5、色谱柱污染

清洗：合适的清洗方式

使用保护柱：请特别注意何时更换保护柱、压力、分离效果、时间、进样次数几个方面。

6、流动相组成发生变化

易挥发性组分挥发：夏天，注意密闭容器，不建议循环使用流动相一相小于10%的在线混合正确配置流动相（V:V）

7、疏水坍塌

C18色谱柱，若没有指明，不得使用100%水作为流动相 （至少含有5%的有机相）使用亲水色谱柱（若水相必须大于95%）：Venusil MP C18、Venusil HLP、Venusil ASB C18，C8

8、建立良好重现性方法

选用质量好的色谱柱、 选用良好的流动相体系、用流动相充分平衡柱子（如MP中含THF，三乙基胺或四丁基铵等胺类调节剂或离子对试剂，特别是烷基上有十个以上的碳原子的情况！）、 采用合适的试验技术，确保日间稳定、 预存色谱柱

1、色谱柱的寿命应有多长

a、操作者对色谱柱的使用和处理

b、注入样品的类型

c、干净样品：进样至少2000次。

保证良好柱寿命与性能的方法 

总体来说色谱柱常见问题症状是柱压过高、峰形不好、保留时间不稳。一般来说色谱柱常见问题原因如下：

色谱柱筛板问题－筛板或柱床部分堵塞；

强保留的样品组分－吸附样品杂质（污物）；

色谱柱填充不好；

柱压问题－机械或热冲击造成空洞

化学影响－基质或键合相被化学侵蚀

有时此类问题并非由色谱柱引起，而是仪器和实验条件！