摘  要 

遗传毒素是一类极富挑战性的杂质，并已被证明即便在低浓度条件下依然具有毒性。因此美国和欧盟的药品监管机构以及人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）都特别指定了它们在原料药和成品药中的限量。通过解析原料药在美国和欧盟注册中涉及到的关于基因毒性杂质控制的法规，为中国制药企业提供相关技术指导以推动中国药品出口事业的增长。

1、药品中的杂质的定义及分类

药品中的杂质定义为无任何疗效、且可能引起副作用的物质。因此，必须控制杂质水平，以确保药品的安全性达到人用要求。杂质会影响药品的安全性和研发时间，例如，药物开发中，如果必须采用多种手段进行杂质表征，并将其去除至可接受水平，所需时间将会显著增加。根据人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）指南，原料药相关的杂质可分为三个主要类别：有机杂质、无机（元素）杂质以及残留溶剂。在这三类中，遗传毒性杂质是一种特例，既便在低浓度条件下也有着重大的安全风险。这是因为它们可能具有致突变性，可能导致DNA 损伤，从而增加罹患癌症的风险。

原料药中的杂质来源包括以下几个方面：①原料及其污染物；②试剂和催化剂；③溶剂；④中间体；⑤降解产物；

为保护患者，需要将药物的杂质水平降到可接受的安全限度内，因此各国都已相继制定了杂质控制指南，这些指南都专注于利用规定限度控制药品中的杂质含量，其中由ICH 与美国食品药品监督管理局（FDA）制定的指南较权威且影响大。例如，ICH Q3A 通过制定杂质的报告、鉴定和认证阈值以监管新原料药中的杂质。ICH Q3B 是其同等的新药杂质指南。ICH Q3C 和 ICHQ3D 分别控制残留溶剂与重金属元素杂质的限量。

已经正式生效的ICH M7 是ICH 专家工作组制定的一本关于药物中DNA 反应性杂质的指南[5]，包括如何根据结构活性分析来评估药品中杂质的潜在基因毒性，如何确定关键毒性阈值（毒性关注阈值TTC）。此外，还论述了一些特别复杂的问题和情景，例如，为什么潜在基因毒性物质具有相似的分子结构，可能相同的反应机理还不能合并用于TTC 的计算。另一个问题是指南试图对不同TTC 值进行澄清，这依赖使用药品的时间长度。

2、基因毒性杂质的定义

ICH S2(R1) 指南中，将遗传毒性定义为“ 一个广泛的术语，指的是遗传物质中的任意有害变化，而不考虑诱发该变化的机制” 。而遗传毒性杂质定义为“ 经过适当遗传毒性试验模型，例如，细菌基因突变（Ames）试验，证实具有遗传毒性的杂质”。潜在遗传毒性杂质（potentialgenotoxic impurity）定义为“ 具有遗传毒性警示结构的杂质，但未经实验测试模型验证” 。

3、有关基因毒性杂质的研究

3.1 在基因毒性杂质来源方面的研究

Szekely 等提供了较详细的分析，列出了具有基因毒性行为的警示结构及与其有关的各种化学反应，这些反应被现代的制药开发及生产厂商普遍使用。同时还将这些基因毒性杂质按照化学反应中起到的不同作用进行分类：①来源于反应物的结构有卤代烷、二羟基硫酸盐、环氧化合物、肼、四甲基哌啶氧化物、芳香胺、硼酸；②来源于副反应的结构有：磺酸酯、卤代烷、乙酰胺。

3.2 在基因毒性杂质分析方面的研究

Liu 等报道了关于药物中遗传毒性杂质痕量分析的研究进展。这篇文章从行业角度阐述了化学品开发中经常遇到的不同结构类型遗传毒性杂质的分析。

Elder 等描述了活性药成分（API）和药品中肼类、酰肼类和腙类遗传毒性杂质的分析。尤其值得注意的是其中使用了多种技术，包括色谱和光谱，且样品大多进行了衍生化处理。

Elder 等报道了API 中苄基卤类及其它相关活性有机卤化物等潜在遗传毒性杂质的分析，并对分离技术进行了分类，包括配有不同检测器（质谱等）的气相色谱和高效液相色谱，以及薄层色谱和毛细管电泳。

3.3 在基因毒性杂质去除方面的研究

Robinson提出了一些遵守监管指南的控制策略，并对每种方法进行举例说明：①重新设计原料药合成途径，以避免引入有问题的杂质；②修改相关工艺参数，以去除此类杂质或将其降低至不显著的水平；③加深工艺理解，以证明特定的遗传毒性杂质不会生产或可被有效去除；④进行毒性研究，以论证可以杂质在设定的低浓度下不具有危害性。Szekely 等提出了在很多实际情况下，具有反应活性和合成用途的反应物及中间体很可能会与DNA 发生反应，而且这类化合物在药物开发阶段很难避免使用以控制或者降低基因毒性杂质，尤其是在工艺放大的阶段更难实现，因此，目前普遍采用的策略为对基因毒性杂质的预防，即关于除去或者降低关键合成步骤中的基因毒性杂质的浓度。他们还分别从两个方面讨论去除基因毒性杂质的方法：①改变合成反应条件，包括改变反应组分的比例；变换反应组分的添加顺序；改变起始物料的质量或者制备方法；采用质量源于设计的理念控制基因毒性杂质等；②优化API 纯化过程，包括调整诸如反应度、溶解度、蒸发度和电离度等冲洗因子和分离技术。

4、基因毒性杂质研究指南

业界和各国的监管机构都已制定了特别针对遗传毒性杂质的指南（表1）

其中与原料药注册密切相关的指南为① PhRMA 意见书；② EMA 杂质限度及其问答指南；③ FDA 行业指南（草案）；④ ICH M7。

4.1 PhRMA 意见书

2004 年PhRMA 成立了一个工作小组来讨论遗传毒性杂质，成果以意见书的形式公开发表。

由于这份意见书的制定和EMA 相关官方指南的制定举措同时进行，结果导致方法有部分重叠。例如PhRMA 文件使用了EMA 草案中毒理学关注阈值（TTC）的概念，而EMA 最终版指南中推荐了由PhRMA 工作小组提出的分期TTC 方法。因此，这两个文件在方法和侧重点上互为补充。

PhRMA 文件引入了两个重要的创新理念：1）遗传毒性杂质的五级分类系统 ①已知具有基因毒性（突变性）和致癌性的杂质，包括已知的动物致癌物和人类致癌物，其遗传毒性机制有可靠数据支持。杂质的遗传毒性本质可由已发表的化学结构数据加以证明。②已知具有基因毒性（突变性），但致癌性未知的杂质，包括基于常规遗传毒性试验证实有致突变性的杂质。③具有警示结构，但与API 结构无关，同时和具有未知的基因毒性（突变性）潜力的结构也无关，包括功能基团结构与遗传毒性相关的杂质。然而，这些基团还未作为单独化合物进行检验，而是基于其化学结构和使用基础知识的构效关系（SAR）专家系统对其进行鉴定。这些警示性的功能基团不存在于API 的结构中。有一些结构被广泛认为具有与DAN 反应的活性，如致突变作用。Müller 等[13] 提出的能与DNA 发生反应的一些警示结构（图1）。

④含有与API 相关的警示结构及与API 结构相同的警示功能基团的杂质。⑤无警示结构或未表现潜在遗传毒性。迄今为止，这项策略已基本上成为业内大多遗传毒性杂质相关风险评估的标准。

2）临床实验材料的分期TTC 概念 分期TTC 意味着可以根据剂量和临床试验的持续时间对其进行调整，使得剂量增加时TTC 降低，持续时间较短时TTC 提高（表2）。根本原因在于临床试验的用药持续时间有限，且总体暴露量相对较低。初始TTC 保守的风险评估意味着该方法对绝大多数物质（强致癌物质除外）具有很高的安全系数。分期TTC 值应适用于开发中的所有阶段以及每一个化合物，以防多种遗传毒性杂质同时存在。这个概念的一个例外是强效致癌物。

两个概念的引入旨在为行业在新药开发阶段提供一些灵活性和风险减轻策略。同时，分期TTC 方法也是EMA 和FDA 遗传毒性杂质指南的一个基本要素。

4.2 EMA 指南

EMA 作为监管机构先驱，推行了处理遗传毒性杂质的详细指南。制定草案的任务由专利药品委员会（CPMP），如今称为人用药品委员会（CHMP）的安全工作组（SWP）承担。SWP 委员会认为具有潜在遗传毒性的杂质是一个特例，没有涵盖在Q3A 和Q3B 指南中，因此当初为了弥补ICH 指南中杂质控制部分的空缺，特别是针对那些可能异常强效的潜在杂质，例如潜在遗传毒性杂质。委员会建议在ICH 限度中加入基于风险的安全因素，这与Q3C 中使用的残留溶剂方法类似。为征询公众意见，在2002 年发表第一版草案，标题为遗传毒性杂质限度意见书。并在2004 年发表完整版。从这次发表以后，欧洲药品管理局的官方缩略名由EMEA 变更为EMA。2006 年6 月，EMA 的CHMP 发布了遗传毒性杂质限量指南的最终版。CHMP 安全工作组发布了一些问答文件进一步解释说明，极大地完善了该指南。文件适用于新原料药中的遗传毒性杂质，也适用于一些现有活性物质的新应用，在这些应用中，与已获得授权的含有相同活性物质的产品相比，其合成路线、工艺控制和杂质分析的评估不能合理保证未引入新的或更高水平的遗传毒性杂质。在目前情况下将一个化合物归类为遗传毒性物质，一般意味着以可能直接损伤DNA 的物质为重点的体外或体内遗传毒性试验，得出了阳性结果。并在充分的后续试验中，评估了独立的体外实验结果与体内试验结果的关联性。

指南建议将遗传毒性杂质分为具有充分（试验）证据证明其阈值相关机理的杂质和无充分（试验）证据证明其阈值相关机理的杂质。并建议将相关实验限定于特定杂质，这些杂质基于化学反应知识、分子结构、原材料中的杂质类型和含量，以及现有的遗传毒性数据，可合理预测其具有遗传毒性。

具有充分证据证明其阈值相关机理的遗传毒性数据杂质将按照ICH Q3C（R3）中的2 类溶剂的方法进行处理。该方法计算“ 每日允许暴露量（PDE）”。根据最相关动物研究中的“ 未观察到的作用的剂量” 或替代性的“ 观察到最低作用的剂量”，并结合多种不确定因素所得。

4.3 FDA 指南草案

2008 年12 月，美国FDA 发布了行业指南草案，原料药和成品药中的遗传毒性和致癌性杂质- 推荐方法。FDA 指南针对已知或可疑的潜在遗传毒性和致癌杂质的安全认证提供了具体建议。指南描述了许多用以表征及减少患者暴露于遗传毒素和致癌性杂质导致的潜在癌症风险的方法。这些方法与EMA 指南相似，包括三个步骤：①改变合成和/ 或纯化路线，使相关杂质生产最少，和/或最大程度去除相关杂质；②将相关杂质的日最大暴露指标1.5 µg 作为总体目标；③进一步表征遗传毒性和致癌性风险，以更好地支持适当的杂质限量指标，无论是上限值还是下限值。

FDA 指南使用与EMA 指南相同或相似的方法；但是，他们也有一些关键区别（表3）。

4.4 ICH M7

已经生效的ICH M7 题为：ICH M7 为限制在药物中具有DNA 活性（诱变性）杂质进行的评估和控制以限制潜在的致癌风险。该指南与现行的EMA 指南相似，特别是警示结构、Ames 试验、TTC 概念的应用及风险评估的相关部分。此外，它还讨论了其他问题，例如怎样处理具有相似作用机理的多种结构相关遗传毒性物质，以及在计算TTC 时是否应对它们求和。

5、结论

以上是原料药在美国和欧盟注册中所涉及到的关于基因毒性杂质控制的法规，在实际申报注册中，申请人应该指明涉及到的所有具有基因毒性或有致癌性的化学物质，如所用试剂、中间体、副产品等。制药企业应该根据现有的生产技术，采用合理的生产方法。如果在合成路线、起始物料方面没有更好的选择，则需要提供一个正当的理由，就是物质中能引起基因毒性和致癌性的结构部分在化学合成是不可避免的。

假如基因毒性杂质被认为是不可避免的，那么应该采取技术手段尽可能地减少基因毒性杂质在产品中的含量，使其符合安全的需要或使其降低到一个合理的水平。对于活性中间体、反应物、以及其它化合物的化学稳定性都应该进行评估。并采用合理的分析方法去检测和量化这些杂质的残留量。