2024年1月，欧盟更新了《GMP和GDP问答》的无菌附录部分，新增了3个问答，更新了1个，删除了5个，有2个问答保持不变。
本次更新主要内容包括：
1. 2022版附录1发布后，内容已经涵盖部分原有问答，对这些问答进行了删除；
2. 部分问答参考的指南内容有变化，更新了这部分问答；
3. 对2022版附录1的部分新条款进行了解释。
新增问答
1. Is rapid method valid for the detection of microorganism within grade A and B? 快速方法是否对A/B级区内微生物的检出有效？
回答：满足附录1中9.28、9.30和9.31要求时，快速方法是可加快微生物检出的替代监测系统之一。
相关条款主要内容：
9.28要求快速和自动化的微生物监测方法应经过验证并证明等同或优于已建立的方法；
9.30给出了微生物污染的行动限，并提示可以使用其它方法，只要这些方法满足相同目的；如果采用不同的或新的技术并且结果不以CFU的方式呈现时，应科学地论证其限度，并尽可能将其与CFU相关联；
9.31对A/B级区检出微生物的鉴定和潜在影响评估进行了要求，并提示应考虑C/D级区检出微生物的鉴定；
拓展阅读：
适用于环境监测的快速方法基于多种科学原理。有些方法仍然需要使用传统的微生物培养方法；然而，如果使用新的检测技术，检测和计数可能会更快，例如：
微菌落的数字成像和自体荧光；
荧光染色和激光激发微菌落；
快速检测二氧化碳（CO2）；
在短暂的微生物富集期后检测三磷酸腺苷（ATP）。
其他快速方法在检测或计数之前不需要微生物生长，因此，结果的时间可以是瞬时的或接近实时的。实现这些结果的快速技术包括：
使用活性染色和激光检测系统的流式和固相细胞术；
ATP生物发光，由于样品中的微生物浓度而不需要富集；
空气或水中微生物的固有荧光和光学光谱检测；
拉曼光谱与活性染色相结合；
核酸扩增技术。
更多内容可参考：药品GMP指南（第2版）无菌制剂分册 第14章 环境监测，该章节对快速微生物方法进行了系统介绍，包括：科学原理、方法优点、方法和设备的验证等。
2. Is an isolator considered as a “closed isolator” if the semi-continuous ingress and/or egress of materials during operations is conducted via reproducible bio-decontamination steps (active VPHP material airlock)? 对于操作过程中物料的半连续进出是通过可重复的生物去污染步骤（如采用主动式VPHP的物料气锁）进行的隔离器，是否被视为“封闭式隔离器”？
回答：
附录1区分了两种类型的隔离器：
封闭式隔离器系统通过与辅助设备的无菌连接而非通向周围环境的开口来完成物料转移，从而防止隔离器内部受到外部污染。封闭系统在整个操作过程中保持密封；
开放式隔离器系统设计为允许物料在操作过程中通过一个或多个开口连续或半连续进出。开口经过设计（例如使用连续正压）以防止外部污染物进入隔离器。
根据附录1术语表定义，设计与使用可重复生物去污染步骤（主动VPHP去污染）的物料转移气锁相接的隔离器可能被视为封闭式隔离器，前提是根据确认/验证研究和监测数据的文件证据，可以证明接口构成了阻隔周围环境的有效屏障。
例如，只要VPHP循环得到验证，并且在装载过程中气锁完整性被打破时，灌装间环境受到密封门（作为屏障）的保护，接着进行去污染循环，然后再打开屏障，这时可能视为封闭式隔离器。应考虑附录1中4.10、4.11和4.12的要求。
需要指出的是，应与相应的监管机构讨论这些要素。
解读（Ian Thrussell）：
This means that an isolator with one or more airlock that has two sealed doors (one to the working enclosure and one to the surrounding room) can be considered a closed isolator if the airlock is gassed using a validated cycle each time it is used.
这是指，如果每次使用气锁时都使用经过验证的VPHP循环对气锁进行充气，则具有一个或多个气锁且具有两个密封门（一个通向工作区域，一个通向周围房间）的隔离器可被视为封闭式隔离器。
相关条款主要内容：
4.10要求任何有可能损害洁净室或关键区域洁净度的活动都应进行评估，如果不能取消这些活动，应采取适当的控制措施；
4.11对物料、设备和组件转移至A/B级区以及从A/B级区移出物品的要求进行了说明；
4.12对气锁设计进行了说明，包括人员气锁和物料气锁；
拓展阅读：
无菌传递是指在生产工艺过程中，产品药液、包材、设备配件、工具、环境监测设备和耗材等生产要素从外部传递进入无菌生产核心区域（这里主要指RABS或隔离器内部）的过程。
在传递过程中，不能有任何污染被传递到RABS和隔离器内部。物品传递进入屏障系统前，通常根据与产品接触的程度（直接接触、间接接触和不接触）进行相应的消毒/灭菌等处理，通过传递舱、气锁、RTP等设备设施进行传递。
常见的带灭菌/去污染功能的传递设备设施有以下3种。
去热原隧道烘箱，应用于散装西林瓶等包材连续的灭菌/去热原，与灌装设备对接，进入A级环境。
电子束灭菌系统（E-Beam）、脉冲强光灭菌系统，应用于对不耐受高温的物品表面进行连续的灭菌，如预填充的巢盒包装表面进行灭菌，与后续的脱内包装设备对接。
汽化过氧化氢去污染传递舱，应用于对表面光滑、规则的不接触产品的部件或经过灭菌处理的带包装的物料的表面去除污染后传递进入核心区域。此类传递舱一般与核心区域对接。
更多内容可参考：药品GMP指南（第2版）无菌制剂分册 第17章 屏障技术，该章节对RABS、隔离器进行了系统介绍，并对VPHP去污染的方法开发进行了详细介绍。
3. What are the requirements for the bioburden sampling to support parametric release? 用以支持参数放行的生物负载取样的要求是什么？
回答：
附录1的10.4规定，对于许可进行参数放行的产品，应制定一个在灭菌循环开始之前针对灌装产品的支持性灭菌前生物负载监测计划，并对每批（亚批）进行生物负载分析。灭菌前灌装单元的取样位置应基于最差条件，并具有批次代表性。应鉴别生物负载检测过程中发现的任何微生物，并确定其对灭菌工艺有效性的影响。在适当的情况下，应监测细菌内毒素/热原的水平。
附录17的4.9规定，应制定产品和组件的灭菌前生物负载监测计划，以支持参数放行。应对每批进行生物负载监测。灭菌前灌装单元的取样位置应基于最差条件，并具有批次代表性。在生物负载检测过程中发现的任何微生物都应进行鉴别，以确认它们不是对灭菌工艺可能更具抵抗力的产孢子微生物。
企业应根据待灭菌的批次或亚批考虑生物负载。
应特别考虑取样、灭菌和检测之间的时间。
任何替代方法都应完全证明合理性，并应考虑：
所涉及的物料，包括包材；
不同亚批中生物负载的均匀性；
微生物的存在；
取样和灭菌之间的时间。
拓展阅读：
目前国内无菌附录无参数放行相关内容，可供参考的内容包括：
PIC/S GMP Annex 17 Real Time Release Testing and Parametric Release - 2023/08/25
PIC/S PI 005-3 GUIDANCE ON PARAMETRIC RELEASE - 2007/09/25
EU GMP Annex 17: Real Time Release Testing and Parametric Release - 2018/06/26
EMA Guideline on real-time release testing - 2012/03/29
FDA Guidance for Industry Submission of Documentation in Applications for Parametric Release of Human and Veterinary Drug Products Terminally Sterilized by Moist Heat Processes - 2010/02
FDA CPG Sec. 490.200 Parametric Release – Parenteral Drug Products Terminally Sterilized by Moist Heat – 2012/07/16
PDA TR 30 Parametric Release of Pharmaceuticals and Medical Device Products Terminally Sterilized by Moist Heat – 2012/05
中国医药质量管理协会 团体标准 湿热灭菌无菌产品参数放行要求 – 2020/07/01
更新问答
1. What is the maximum acceptable bioburden level? H+V May 2013 生物负载的最大可接受水平是多少？
回答：
2019年1月更新：本问答已被Guideline on the sterilisation of the medicinal product, active substance, excipient and primary container取代，请参考该指南。
生物负载的质量标准应不超过10 CFU/100ml，与上述指南保持一致。
在安装了预过滤器的情况下，除非另有正当理由，原则上可以在第一次过滤前达到10 CFU/100 ml的生物负载限度，并且这从GMP的角度是强烈建议的。两个连续的除菌过滤器的能力强并不能用于证明更高的生物负载限度是合理的。
然而，当提交了适当的理由（涉及发酵或其他生物或植物成分的工艺，眼科制剂使用纯化水等）时，预过滤前高于10 CFU/100 ml的生物负载限度可能是可以接受的。在这种情况下，应证明第一个过滤器有能力在最后一次过滤前控制生物负载不超过10 CFU/100ml。
变化说明：
仅参考的指南版本变化，生物负载限度均为10 CFU/100 ml，其他说明无变化。
已删除问答
1. How should the integrity of sterilising filters be verified? H+V June 2007
如何确认除菌过滤器的完整性？
说明：原问答仅提及使用前和使用后的完整性测试，而2022版附录1对过滤器完整性测试提出了新的要求，如PUPSIT，详情可参考附录1最新内容。
2. What are the key changes in the 2008 revision of annex 1 of the EU GMP? H+V January 2010
EU GMP附录1 2008版有什么主要变化？
说明：2022版正式版已发布。
3. The new revision to the annex includes a number of revised requirements. What steps are being taken by EU authorities to assure the consistent interpretation of the requirements of the revised annex by EU GMP inspectors during inspections? H+V January 2010
新的修订稿有很多修订要求，欧盟将采取什么措施，以确保欧盟GMP检查员在检查过程中对这些要求解释的一致性？
说明：原问答引用了PIC/S发布的文件：PI 032-2 Technical Interpretation of Revised Annex 1 to PIC/S GMP Guide - 2010/01/08，PIC/S官网现已撤销。
4. For an aseptically produced product, where should bioburden monitoring take place? H+V May 2013
对于无菌生产产品，应在哪里进行生物负载监测？
说明：2022版附录1 8.93条对该问题进行了解答：8.93 生物负载样品应取自待灌装/分装产品，并在最终除菌过滤前即时取样。如果使用冗余过滤装置，应在第一个过滤器之前进行取样。取样系统应经过设计不引入污染。
5. Do I need to follow the requirements of the updated ISO 14644 part 1 standard?
是否需要遵循ISO 14644 第1部分更新后的要求？
说明：2022版附录1 4.25条指出，洁净室和洁净空气设备的确认可参考ISO 14644系列标准，8.28条指出，对于洁净室的分级，采样点的最小数量及其位置可参见ISO 14644第1部分。
未变化的问答
1. What are the sampling requirements for sterility testing when a finished product batch of a terminally sterilised medicinal product is made up of more than one steriliser load? H+V October 2008
当一批最终灭菌产品有多个灭菌装载时，成品无菌检验取样的要求是什么？
2. Water for injection by reverse osmosis
反渗透法制备的注射用水（WFI）
