摘 要： 建立高效液相色谱-串联三重四级杆质谱测定西格列汀中亚硝胺类杂质Nitroso-STG-19（NTTP）的方法。西格列汀样品用水溶解，以乙酸乙酯为提取溶剂进行超声提取，离心后取乙酸乙酯层，用Agilent Infinity Lab Poroshell 120 SB-AQ色谱柱（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）分离，柱温为40 ℃，以水（含0.1%甲酸）和甲醇（含0.1%甲酸）为流动相，梯度洗脱，流量为0.6 mL/min。采用大气压化学电离源、正离子扫描、反应监测模式进行检测。NTTP的质量浓度在0.2～3.0 ng/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数为0.998，检出限为0.750 ng/g，定量限为1.500 ng/g。测定结果的相对标准偏差为2.7%（n=6），样品加标平均回收率为101.0%。该方法可为控制西格列汀中NTTP的含量提供方法支持。

关键词： Nitroso-STG-19； 高效液相色谱-串联三重四极杆质谱； 西格列汀

 

2022年8月9日，美国食品药品监督管理局(FDA)官网发文称，在一种用于治疗Ⅱ型糖尿病(T2DM)的处方药西格列汀中发现了亚硝胺类杂质Nitroso-STG-19，化学名为7-亚硝基-3-(三氟甲基)-5，6，7，8-四氢-[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪，简称NTTP[1]。为避免药物短缺并确保患者获得充足的药物供应，FDA不会禁用西格列汀，但需要控制用量。NTTP属于亚硝胺类化合物，是公认的具有较高致癌性的化合物，目前虽然还没有可靠的数据来直接评估NTTP致癌的可能性，但FDA用与其密切相关的亚硝胺化合物的信息来计算NTTP终生暴露限度。FDA指出，NTTP的临时可接受摄入量为每天246.7 ng，终生暴露水平为每天37 ng。临时可接受摄入量引发的癌症风险水平大于终生暴露水平，因此NTTP的可接受摄入量应为每天37 ng。

西格列汀是全球第一个上市的口服降糖药，属于二肽基肽酶-4 (DPP-4)抑制剂，由美国默沙东研制和销售，该药是Ⅱ型糖尿病患者必需的独家重磅产品[2‒3]。西格列汀于2006年10月获得美国FDA批准，可单药或与二甲双胍、噻唑烷二酮类药物联合使用，用于改善Ⅱ型糖尿病的血糖控制[4‒6]。2007年4月，西格列汀与二甲双胍的复方制剂在美国获批上市[3]。西格列汀市场份额大[7‒10]，而西格列汀中NTTP含量控制成为药物质量控制的重要任务。

亚硝胺杂质在极低暴露量的情形下具有高度致癌性，常规的色谱分析方法难以达到灵敏度要求[11]，而更高灵敏度的质谱仪器广泛用于亚硝胺杂质的研究中，以保证亚硝胺类杂质能够准确有效地检出[12‒15]。袁松等[16]采用电喷雾离子源(ESI)，建立了超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法测定磷酸西格列汀中基因毒性杂质NTTP，该方法回收率偏高，且需要控制进样盘温度，方法较为繁琐。笔者利用大气压化学离子源(APCI)，建立高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法测定西格列汀中NTTP。该方法对目标化合物分离效果良好，专属性强，灵敏度高，可为西格列汀中NTTP的检测提供参考。

 

1、 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱-质谱联用仪：TSQ-Quantis型，美国赛默飞世尔科技公司。

电子天平：(1)QUINTIX125D-1CN/SQP型，感量为0.01 mg；(2)BSA224S-CW型，感量为0.1 mg；德国赛多利斯公司。

超纯水机：FDY8002-UV-E型，青岛富勒姆科技有限公司。

旋涡混合器：QT-2A型，上海琪特分析仪器有限公司。

乙酸乙酯、甲酸、甲醇：均为色谱纯，上海星可高纯溶剂有限公司。

NTTP对照品：纯度(质量分数)为98.3%，批号为22359174 s-WJ-01，斯坦德科创医药科技(青岛)有限公司。

西格列汀片样品：50 mg/片，批号为STD-005-001，某企业提供。

实验用水为超纯水，由青岛富勒姆超纯水机制得，临用新制。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Infinity Lab Poroshell 120 SB-AQ柱(100 mm×3.0 mm，2.7 μm，美国安捷伦科技有限公司)；流动相：A相为0.1% (体积分数)甲酸水溶液，B相为0.1% (体积分数)甲酸-甲醇溶液，流量为0.6 mL/min；柱温：40 ℃；进样体积：20 μL；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1   梯度洗脱程序

Tab. 1   Gradient elution procedures

 

1.2.2 质谱条件

离子源：大气压化学离子源(APCI)；电离方式：正离子；汽化器温度260 ℃；离子转移管温度：260 ℃；检测方式：反应监测(SRM)模式；母离子：m/z 222.125；子离子：m/z 192.00 (定量离子)、165.113、177.024；去簇电压：85 V；碰撞能量：19.49、21.26、10.22 eV。

1.3 溶液配制

空白基质溶液：称取5 g西格列汀片空白辅料于锥形瓶中，准确加入50 mL水，涡旋60 s，准确加入50 mL乙酸乙酯，涡旋30 s，超声10 min，以12 000 r/min转速离心5 min，取乙酸乙酯层即得。

NTTP对照品储备液：600 ng/mL，精密称取NTTP对照品适量，用水溶解、稀释并定容。

NTTP对照品中间溶液：15 ng/mL，精密量取NTTP对照品储备液适量，用水逐步稀释并定容。

NTTP对照品校准溶液：1.5 ng/mL，精密量取NTTP对照品中间溶液适量，置于离心管中，准确加入2 mL水，涡旋60 s，再加入2 mL空白基质溶液，涡旋30 s，超声10 min，以12 000 r/min转速离心5 min，取空白基质溶液层，即得。

NTTP系列校准溶液：精密量取NTTP对照品中间溶液20、60、200、300、400 μL，按照NTTP对照品校准溶液配制方法，配制成质量浓度分别为0.2、0.4、1.5、2.2、3.0 ng/mL的NTTP系列校准溶液。

样品溶液：将固体西格列汀片研碎，精密称取0.2 g样品，置于10 mL离心管中，准确加入2 mL水，涡旋60 s，准确加入2 mL乙酸乙酯，涡旋30 s，超声10 min，以12 000 r/min转速离心5 min，取乙酸乙酯层，即为样品溶液。

1.4 实验方法

取NTTP对照品校准溶液和样品溶液，按照1.2仪器工作条件进样分析，记录色谱峰面积，按照色谱峰面积外标法计算样品中的NTTP含量。

 

2、 结果与讨论

 

2.1 色谱条件优化

2.1.1 色谱柱温度

称取样品适量，精密称定，加入NTTP对照品中间溶液200 μL，按样品溶液配制方法制备加标样品溶液。调整色谱柱温度分别为35、40、45 ℃，其他仪器条件按1.2设定，每种温度下各平行测定2次，计算测定结果的相对标准偏差(RSD)，结果见表2。由表2可知，色谱柱温度在35～45 ℃范围内，测定结果的相对标准偏差为2.5%，表明在该温度范围内色谱柱温度对测定结果的影响较小，灵敏度可达到检测要求。考虑到仪器自身的波动性，选择色谱柱温度为40 ℃。

表2   不同色谱柱温度时的测定结果

Tab. 2   Determination results at different column temperatures

 

2.1.2 柱流量

称取样品适量，精密称定，加入NTTP对照品中间溶液200 μL，按样品溶液配制方法制备加标样品溶液。调整色谱柱流量分别为0.54、0.60、0.66 mL/min，其他仪器条件按1.2设定，每种流量下各平行测定2次，计算测定结果的相对标准偏差，结果见表3。由表3可知，色谱柱流量在0.54～0.66 mL/min范围内，测定结果的相对标准偏差为3.8%，表明在该流量范围内流量对测定结果影响较小，灵敏度可达到检测要求。考虑到仪器自身的波动性，选择柱流量为0.60 mL/min。

表3   不同柱流量时的测定结果

Tab. 3   Determination results at different column flow rates

 

2.2 方法专属性

取空白基质溶液、样品溶液、对照品溶液，按所建方法分别进行测定，记录色谱图(如图1所示)。由图1可以看出，在优化的仪器工作条件下，NTTP在4.867 min出峰，空白基质溶液、样品溶液对目标峰无干扰，该方法专属性良好。

图1   空白基质溶液、样品溶液和NTTP对照品溶液总离子流图

Fig.1   Total ion chromatograms of blank matrix solution，simple solution，NTTP reference solution

 

2.3 线性方程和检出限、定量限

在1.2仪器工作条件下，测定NTTP系列校准溶液，以目标物的质量浓度为横坐标(x)，以对应的色谱峰面积为纵坐标(y)，绘制校准曲线。计算得线性方程为y=1 548.454 2x-86.605 1，相关系数为0.998。表明NTTP质量浓度在0.2～3.0 ng/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好。

将NTTP对照品校准溶液逐级稀释，在1.2仪器工作条件下测定，分别以3倍和10倍信噪比对应的质量浓度作为方法检出限和定量限，根据称样质量和定容体积换算成样品中的含量，以质量分数(ng/g)表示。计算得方法检出限为0.750 ng/g，定量限为1.500 ng/g。

2.4 精密度试验

取同一批样品，平行称样6份，每份称取约0.2 g，分别加入NTTP对照品中间溶液200 μL，按样品溶液配制方法制备加标样品溶液，在1.2仪器工作条件下进行分析，结果见表4。由表4可知，6份加标样品溶液测定结果的相对标准偏差为2.7%，表明该方法精密度良好。

表4   精密度试验结果

Tab. 4   Results of precision test

 

2.5 样品加标回收试验

取同一批样品，平行称样3份，每份称取约0.2 g，分别加入NTTP对照品中间溶液60、200、300 μL，进行低、中、高3种浓度水平的加标回收试验，每种加标水平取样3次进行分析，结果见表5。由表5可知，样品加标平均回收率为101.0%，表明该方法准确度良好，满足痕量物质的检测要求。

表5   样品加标回收试验结果

Tab. 5   Results of spiked recycling test

 

2.6 溶液稳定性试验

取NTTP对照品溶液和加标样品溶液，分别于配制完成后第0、6、12、18、36 h取样测定，计算色谱峰面积，结果见表6。由表6可知，NTTP色谱峰面积测定结果的相对标准偏差分别为6.2%、6.7%，表明NTTP对照品溶液和加标样品溶液在36 h内稳定性均良好。

表6   溶液稳定性试验结果

Tab. 6   Results of solution stability test

 

3、 结语

 

建立了测定西格列汀中基因毒性杂质NTTP的高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法。用乙酸乙酯溶剂处理样品，毒性较小，大幅度降低了对人员和环境的影响。该方法操作简单，具有良好的线性、准确度和精密度，可为控制西格列汀中NTTP的含量提供方法参考。

 

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引用本文： 刘雪，刘春霞，冯今奋，等 . 高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法测定西格列汀中Nitroso-STG-19［J］. 化学分析计量，2024，33（9）：69. (LIU Xue, LIU Chunxia, FENG Jinfen, et al. Determination of Nitroso-STG-19 in Sitagliptin by high performance liquid chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(9): 69.)