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嘉峪检测网 2017-02-10 18:13
诺如病毒,又称诺瓦克病毒,可感染人和动物引起急性肠胃炎、冬季呕吐性疾病、胃肠性流感等,是非细菌性胃肠炎的主要病原体之一。
诺如病毒是一种单链RNA病毒,主要分为6个基因型(GI-GVI),其中常见的世界性流行诺如病毒基因型主要为GI和GII。
诺如病毒最初是通过电镜检测发现的,因此最初的诺如病毒诊断方法主要是电镜法(EM)与免疫电镜法(IEM),通过电镜观察病毒粒子的形态来确认,需要的病毒浓度较高(一般电镜法需要病毒浓度约为106病毒粒子/mL,免疫电镜法灵敏度比普通电镜法要高10倍左右),因此灵敏度与特异性相对较低,并且只能够在比较专业的检测机构才能进行,无法进行普及。
随着人们对诺如病毒的不断研究,免疫法逐渐被用来检测诺如病毒。免疫法主要有放射免疫法(RIA)、生物素-亲和素免疫法(Biotin-Avidin Immunoassy)以及酶联免疫法(ELISA)。RIA的灵敏度要比IEM高10-100倍,但需要使用放射元素进行标记,且需要时间较长(6d);Biotin-Avidin Immunoassy是美国疾病预防控制中心基于RIA建立的简化方法,灵敏度与RIA相近;ELISA具有灵敏度高、耗时少、经济的优点,便于广泛推广,但株型特异性太强,应用范围较狭窄。
分子生物学的飞速发展,带来了多种更加灵敏、特异、快速的核酸检测方法,包括等温核酸扩增(NASBA)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、荧光染料RT-PCR、荧光探针RT-PCR、多重RT-PCR等,是目前检测诺如病毒应用最广泛的方法,被称为检测诺如病毒的“金标准”。NASBA直接扩增RNA来进行检测,仪器相对简便,通过琼脂糖凝胶电泳、印迹杂交或者荧光检测来鉴定结果,灵敏度低于RT-PCR;RT-PCR通过逆转录RNA模板、PCR扩增特异性产物,使用琼脂糖凝胶电泳来鉴定结果;荧光染料RT-PCR通过向RT-PCR反应体系中添加非特异性的荧光染料,可以在反应过程中监测扩增产物的生成量,但需要做熔解曲线分析来确定反应的特异性;荧光探针RT-PCR通过特异性的荧光探针与引物,可实时监控反应过程中特异性产物的变化,并且可以实现同一管中多个基因的检测(多重),特异性较好,假阳性率低,检测灵敏度可达10-100拷贝/反应,可用于取代普通RT-PCR。
在核酸检测中,有几个因素影响检测结果。由于诺如病毒无法像常规致病菌那样经过简单增菌进行扩增,只能通过在样本中的富集来提高其浓度,因此样本处理以及病毒富集浓缩是检测的关键。目前样本中诺如病毒的富集浓缩主要有两种方式,固体样本以及粘度较高的液体样本可以使用PEG沉淀法,水以及粘度较低的液体样本可以使用膜过滤法。富集后的样本经过核酸提取(试剂盒或其他方法)得到核酸,其完整程度和纯度对下一步的核酸检测有较大的影响。
Real-Time RT-PCR技术的应用,不仅能够快速、特异的检测低浓度的诺如病毒感染,而且能够同时检测诺如病毒、星状病毒和轮状病毒等,操作相对简便,减少了整个检测过程中由操作带来的污染,并且能够进一步对病毒的基因型进行研究,是未来诺如病毒检测的发展趋势。但复杂样品的前处理、低含量样品的浓缩、病毒变异株的识别以及特异性的提高还有待进一步的研究。
来源:良润生物