什么是内毒素？

内毒素是包在革兰氏阴性细菌外膜中的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）。它们代表了制药和医疗设备企业而言最重要的热原。内毒素之所以重要，是因为它们在环境中无处不在，热稳定好且不可以过滤去除。重要的是，它们极易热解。内毒素刺激单核细胞和巨噬细胞分泌一系列炎症细胞因子，包括肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor，TNFα）、白介素（IL）-1族、IL-6、IL-8、IL-10族、IL-12族、IL-15族和转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGFβ）。

通常，LPS具有三个结构组件。脂质A、LPS疏水部分、亲水性杂多糖核心区域和O型特异性寡糖区域，他们在血清型中因菌株而异。核心区域的第一个糖（3-脱氧-D-甘露糖辛酸或KDO）连接到6'位置，并将核心多糖连接到脂质A。LPS的所有生物活性都存在于脂质中一个区域。

脂质A具有一个在位置1'和4'处带有磷酰基的β二葡萄糖胺主链。对于大肠杆菌和革兰氏阴性细菌肠杆菌科的其他成员，此主链在2、3、2'和3'位置被β-羟基肉豆蔻酸酯酰化。仲酰基分别在2'和3'位置被月桂酸酯和肉豆蔻酸酯化。这里描述的脂质A结构是经典结构，并且是天然免疫应答最强大的激活剂之一。

并非所有革兰氏阴性生物都产生激活先天免疫应答的脂质A结构。活化取决于磷酰基的存在，酰基链的数量和酰基链的长度。来自幽门螺杆菌，鼠疫耶尔森氏菌和土拉弗朗西斯菌的LPS具有致病性，但是它们的LPS结构很难被Toll样受体（TLR4）识别，因此可以逃避宿主检测。即使在肠杆菌科家族中，经典的LPS体系结构也会发生变化。在低镁和低pH的条件下，发生棕榈酸酯添加和糖脂A磷酸基团与阳离子糖或磷酸乙醇胺的修饰。在高铁、铝和钙的环境中也会发生改性。来自所有革兰氏阴性细菌的LPS不断进行修饰或重塑。脂质A的重塑取决于环境条件，并主要通过PhoP-PhoQ和PmrA-PmrB两组分调节系统进行控制。

革兰氏阴性细菌的外膜高度不对称，内部小叶中含有甘油磷脂，而暴露于细胞表面的LPS则含有LPS。它用作渗透屏障。大多数营养物质通过称为孔蛋白的外膜蛋白（OMP）家族穿过此屏障。外膜的变化会影响其完整性、流动性和渗透性。LPS和外膜成分的重塑代表了一种协调的生存方式。外膜囊泡（OMV）具有革兰氏阴性细菌分泌过程，可促进外膜的重塑。

外膜囊泡是由革兰氏阴性细菌普遍产生的纳米颗粒。它们的直径范围为20–250nm，并且包含不再需要的或对生存有害的蛋白质、脂质、LPS和其他生物活性物质。它们通常具有与精心制作OMV的细菌外膜相似的成分。OMV产生是细菌的应激反应，对于养分获取、生物膜发育、水平遗传交换以及复杂微生物群落中发生的其他种间相互作用具有重要作用。这些区经常处于温度和营养压力之下。这些微生物群落的内毒素无法在实验室中产生，因为存在季节性和其他本地因素，这些因素赋予了当地特色。这些微生物种群存在于所有制药操作中。

过去

1912年，Hort和Penfold开发并完善了一种兔子动物模型，该模型促进了注射热的研究。他们对兔子模型精心控制了品种、性别、体重、食物和环境饲养条件。在每个实验中都报告了剂量。间隔30分钟进行温度测量。实验设计使他们能够最终证明，当使用新鲜蒸馏水进行静脉注射时，不存在发烧体（FPB）。Hort和Penfold取消了与以下各项有关的所有理论：（a）水热，（b）盐热，（c）碳水化合物热，（d）发酵热和（e）组织热。不幸的是，直到1923年，他们的工作才得到适当的认可。

1923年，Florence Seibert认可了Hort和Penfold进行科学研究的基本价值。她对注射热的研究使用了他们开发的相同的兔子模型。Seibert成功地确认并扩展了前提条件，即蒸馏水中的热源材料是细菌来源的，并且这些材料不会通过过滤除去。最重要的是，她介绍了“一种制备非热源水的方法”。她的制备非热原性蒸馏水的方法包括用碱将连接塞子加热几次（去热原），并在蒸馏瓶上方引入一个“收集器”。捕集并防止热原被机械地带入馏出物中。

随着1930年代整个肠胃外产业的兴起以及二战之前和二战期间对肠胃外解决方案的大量需求，确保商业肠胃外解决方案不受热原污染的需求触发了美国药典（USP）的发展，热原体药典测试应运而生。1941年，USP、NIH、FDA和14家制药公司合作开展了热原测试的第一项研究。该研究利用了由Hort，Penfold和Siebert开发的兔子模型，合作的结果导致在1942年的USP第12版中包括了第一个药典热原试验。该试验需要静脉注射溶液和一组兔子的直肠温度测量三个小时。

在1964年至1968年期间，Levin和Bang报道革兰氏阴性细菌内毒素具有凝结大西洋马蹄蟹血液的能力。他们确定对血液中细菌内毒素的敏感性（源自革兰氏阴性细菌）是由于其血细胞，变形细胞中的酶。由于测试是基于鲎（血鲎），并且由于所述酶从获得的鲎细胞通过裂解具有高纯度的蒸馏水，试验被评为鲎变形细胞溶解物，或LAL。Levin and Cooper于1971年发表的一篇文章报道说，与RPT相比、LAL（鲎试剂）更灵敏且成本更低。 它激发了全世界对于确定BET作为RPT替代品的适用性的兴趣。

1973年，FDA公布了用于生产LAL的拟议生产规范。LAL的制造商必须在使用前向FDA提交每批样品以进行测试。临时使用LAL可使行业获得实际经验。常规上使用创新的LAL测试来测试原材料，过程中的样品，首批（FOB）和批中（MOB）样品。批次结束（EOB）样品需要兔子测试，因为EOB被认为是最坏的情况。

最大的医疗设备和LVP生产商Baxter Travenol认识到LAL测试的简单性和耐用性，于1973年做出了一项公司决定，将LAL验证为其全球设施的内毒素测试。在1979年和1982年，他们报告了其年度内毒素检测结果。这些数据包括66594 USP兔热原测试和356548 LAL测试。值得注意的是，两种方法均测试了404个自然污染的样品。LAL测试确认了内毒素的存在，所有404个样品均未通过测试。但是，按照USP第<151>章热原测试，对所有404个样品进行的八次兔子测试仅导致19次失败。这些数据明确表明，LAL是更灵敏的方法，革兰氏阴性细菌内毒素是对肠胃外产品制造影响最大的热原。这些数据和45年的经验证明了LAL测试的特异性（检测一系列内毒素的能力）。如下表1所示。

现在

商业重组蛋白正在被开发，以替代目前在药典中定义的天然来源的LAL试剂。三种产品均基于因子C，这是LAL级联中的第一个内毒素结合因子。还正在开发包含亚洲（Tachypleus）和美国（Limulus）马蹄蟹物种的所有三种凝血因子的重组产品。旨在证明当前药典方法与重组方法等效的研究很大程度上是基于对纯化LPS的比较检测或注射用水（WFI）的清洁样品的比较确定的。然而，这些研究并未解决特异性问题，即检测多种天然环境内毒素的能力。

几项研究已使用环境内毒素将rFC与LAL进行了比较。Thorne等人检查了10家畜牧生产设施的空气样本。研究设计，样本量和统计评估都非常出色。但是，来自牲畜设施的空气样本并不代表制药生产环境。另外，在此采样中与细菌相关的内毒素更可能代表肠道，而不是通常居住在水系统中的非发酵罐。Kikuchi确实检查了来自各种水源的环境内毒素。样品集非常有限，但是尽管如此，数据表明重组方法可能会低估自然污染水的内毒素浓度。

Akers等。最近比较了所有目前比较rFC和LAL的文献。他们的审查得出的结论是，当前可获得的所有数据都证明了rFC的适用性，但没有证明可比性。他们注意到，大多数声称具有可比性的已发表研究包括来自测试文章的数据，这些数据在制造过程的任何环节中均没有可测量的自身内毒素活性。当测试物品中的被测杂质（在这种情况下为内毒素活性）处于可定量水平时，就无法主张可比性。分析物（RSE或CSE）的回收率在实验上并未确认替代方法回收天然产物污染物的能力。

Charles River最近完成了一项评估，该评估同时检查了三种市售重组C因子产品，正在开发的单个重组LAL级联和两种FDA许可的LAL试剂。来自欧洲肠胃外生产设施的药物预处理水样品用于评估重组试剂的特异性。这项研究利用了统计学上相关的样本集。它证明了所有重组试剂都有可能低估天然内毒素的浓度。低估不是由于LAL试剂的葡聚糖偏差造成的，因为羧甲基化的凝胶多糖被用作Charles River LAL试剂的葡聚糖阻滞剂，并且两种LAL试剂均产生相似的结果。另外，这项研究的结果表明，所有重组产品都需要进一步开发，以检测108年前Hort，Penfold和Seibert鉴定出的发烧体（内毒素）。

未来

测量和检测居住在纯净水系统中的微生物群落产生的所有内毒素的能力（Burkholderiaceae，Methylobacteriaceae，Comamonadaceae类/科的成员）对于WFI系统的操作控制绝对必要。目前，LAL测试的重组替代品不能始终如一地做到这一点。必须在重组蛋白质化学或重组制剂方面取得进一步进展。对LAL重组替代品的提炼必须考虑对天然环境内毒素的反应性，而不是高度纯化的脂多糖标准品。药典LAL测试与任何重组替代品之间的差异必须科学解决。与1980年代初期采用LAL测试类似，

LAL不是单一酶，LAL不是三种酶，LAL确实包含三种蛋白酶酶原，已知它们与细菌内毒素的顺序激活有关。LAL还包含对β1-3葡聚糖敏感的G因子酶。LAL包含可溶性蛋白质凝结原，可通过活化的凝血酶将其转化为不溶性凝胶。LAL还包含三种丝氨酸蛋白酶抑制剂样蛋白，可调节LAL内毒素和葡聚糖激活级联反应。LAL包含抗LPS因子，可中和细菌内毒素，抗微生物肽，α2-巨球蛋白，大防御素和胱抑素。LAL是鲎450万年原始的免疫系统，和人类鲎将继续作为针对人类和动物注射药物的有效且可靠的安全性测试。我们认识到，人们对大西洋horse的种群可持续性存在担忧。Charles River开发了一种基于弹药的微流LAL测试，该测试可将LAL资源减少至95％。Charles River和所有FDA许可的LAL制造商，数十年来都制定了保护和教育计划，以确保对这一杰出物种的保护。

文章来源：

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