摘要  目的: 建立聚乙二醇3350分子量与分布测定方法,并对3个厂家9批样品进行比较研究。方法: 采用Waters凝胶渗透色谱（GPC）处理系统、示差折光检测器进行分子量及分布测定,采用TA 差示扫描量热仪（DSC） q2000系统对样品的热效应进行研究。结果: 该方法以分子量400~5 800范围内的聚乙二醇对照品建立三阶校正曲线,回归系数0.999 9,各校正点平均偏差均小于2%,能够准确测定聚乙二醇3350的重均分子量、分布系数等信息；DSC测定图谱能够反映样品的纯度,进一步确认相关质量。结论: 高效凝胶渗透色谱方法是测定聚乙二醇相关辅料分子量及分布的可靠方法,用于确定重均分子量、分布系数等多分散化合物关键质量参数具有操作简单、结果准确的特点,配合差示扫描量热法能够分辨更多的质量属性,可用于产品质量均一性监控和辅料对比筛选研究。

 

关键词: 分子量与分布；高效凝胶渗透色谱；差示扫描量热法；聚乙二醇3350

 

Investigation of molecular weight distribution of pharmaceutical excipient polyethyleneglycol 3350

 

CHENG Jiye, JIN Weibin, GU Xiaofeng, ZHOU Zhenyu

(Suzhou Institute for Drug Control, Suzhou 215104,China)

 

Abstract Objective:  To establish a method for the determination of molecular weight distribution of polyethylene glycol 3350 and compare the differences of 9 batches of samples from 3 enterprises. Methods: The molecular weight and distribution of the samples were determined by Waters high performance gel permeation chromatography system(GPC) and differential refractive index detector. The thermal effects of the samples were confirmed by TA differential scanning calorimeter q2000 system(DSC). Results: The established method can accurately determine the weight-average molecular weight anddistribution coefficient of PEG 3350 by establishing a third-order calibration curve with PEG as a reference substance in the molecular weight range of 400-5800. The regression coefficient was 0.999 9, and the average deviation of each calibration point was less than 2%. The DSC spectrum can reflect the purity of the sample and further confirm the relevant quality. Conclusion: High performance GPC is a specific and accurate method for the determination of molecular weight and distribution of PEG-related excipients and can be applied to the determination of the weight-average molecular weight and distribution coefficient which is the key parameters of polydisperse compounds. In combination with differential scanning calorimetry,the method can identify more quality attributes, and be used for product quality uniformity control and excipients comparative screening study.

Key words: molecular weight anddistribution；highperformance gel permeation chromatography；differential scanning calorimetry；polyethylene glycol 3350

 

聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)是一类化合物的总称,由环氧乙烷与水逐步缩合而成的聚合物,分子式为HO（CH2CH2O） nH,其中n代表氧乙烯基的平均数,通过控制反应条件可以获得一系列分子量（200~20 000）的产品。PEG水溶性好,低毒,生物相容性好,化学性质稳定,作为增塑剂、润滑剂、改性载体、稳定剂等广泛用于医药、日用化学等领域。PEG 3350的制剂临床用于慢性便秘所致的肠易激综合征的治疗[1],在欧洲是临床一线疗法,也用于修饰抗体药物和蛋白质药物、制备前药,可以提高稳定性,优化药物在体内的药动学特性[2]。不同分子量的聚乙二醇在吸水性、润湿性等方面有较大差异,对临床使用和制剂的释药性能具有重要影响[3-5],因此建立准确可靠的分子量与分子量分布测定方法十分必要。各国药典（USP 43、EP 10.0）控制聚乙二醇分子量的方法均为端基分析法,通过酸碱滴定测定分子链末端氢氧根数量,折算平均分子量,该方法不能反映分子量分布信息,且操作过程繁琐,实验过程影响因素较多[6-7],结果对人员操作要求较高。高效凝胶渗透色谱利用体积排阻原理将分子量大小不同的物质有效分离,近年来在高聚物分子量分布研究中应用广泛[8]。本文以此法为基础,对影响测定结果的色谱条件及软件处理参数进行了考察和优化,对比了多家企业产品,同时对发现的差异通过差示扫描量热法进行了热效应曲线研究。本法结果准确、重现性好,可用于聚乙二醇相关产品的质量控制。

 

1  试验部分

 

1.1  仪器与试剂

 

高效液相色谱仪（配有示差折光检测器,Waters公司e2695-2414）；差示扫描量热仪（TA公司q2000）,铝坩埚（TA公司Tzero T180830）；电子分析天平（METTLER TOLEDO公司XS205DU）；超纯水仪（MILLIPORE公司Milli-Q）；微孔滤膜（国药集团化学试剂有限公司0.22 μm）。硝酸钠（分析纯,国药集团化学试剂有限公司,批号:  20150508）；ProClinTM（SIGMA-ALDRICH,批号: MKCH7182）。

 

1.2 对照品与样品

 

PEG对照品（分子量范围430~5800,德国PSS公司,批号: pegkit-08）；PEG 3350（9批样品来自于国内3家辅料企业,辽宁A厂（批号180810387、180810388、180810389）,上海B厂（批号35187、35188、35189）,上海C厂（批号4453325、4447021、4480104）,编号分别为A1~A3；B1~B3；C1~C3）。

 

2  方法与结果

 

2.1  色谱条件

 

色谱柱: AgilentPL aquagel-OH 20（7.5mm×300 mm,8 μm,Agilent公司）；流动相: 0.1 mol·L-1硝酸钠溶液（含0.02% ProClinTM）；流速: 0.5 mL·min-1；柱温: 35 ℃；检测器温度: 35℃；进样体积: 100 μL。对照品进样类型为窄分布标准进样,供试品进样类型为宽分布样品进样。

 

2.2 热分析条件

 

称取待测物约3 mg置铝坩埚中,分散均匀,压盖封装,以空铝坩埚为参比,进行测试。气氛: 氮气；流速50 mL·min-1；升温程序: 起始25 ℃,迅速升温至40 ℃,以2 ℃·min-1的速度升温至80 ℃,记录热效应曲线。

 

2.3 溶液的制备

 

2.3.1  流动相

 

称取硝酸钠约8.5 g,加水适量溶解,加入ProClin 0.2 mL,用水稀释至1 000 mL,混合均匀,用0.22 μm微孔滤膜滤过。

 

2.3.2  供试品溶液

 

取本品约0.1g,精密称定,置于50 mL量瓶中,用流动相使完全溶解并稀释至刻度,摇匀。

 

2.3.3  对照品溶液

 

取聚乙二醇系列对照品各约20 mg,精密称定,分别至10 mL量瓶中,加流动相振摇,使完全溶解并稀释至刻度,摇匀。

 

2.4 测定法

 

分别取对照品溶液和供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件,进样,记录色谱图。分别输入相应的标示分子量及分布系数,以对照品保留时间（T）为横坐标、以分子量对数(LogM)为纵坐标,建立三阶校正曲线,将供试品主峰保留时间带入校正曲线,计算重均分子量（Mw）及分布系数。

 

2.5 进样精密度

 

与普通液相色谱不同,进样量较小时（20 μL）PEG峰高较小,受基线影响积分重复性差,提高样品浓度（1 mg·mL-1）,峰出现一定的展宽现象。经过试验,进样量为100 μL、样品浓度0.2·mg-1时,峰高适宜、进样重复性好（供试品6次进样保留时间的RSD%为0.21%）。

 

2.6 方法重复性

 

取一批供试品（A1）,按“2.3”项下方法平行制备6份溶液,依法测定,结果Mw分别为3 363、3 349、3 358、3 362、3 354、3 341,RSD% 0.25,与进样精密度一致。多次取样制备供试品溶液,测定的平均分子量结果一致,说明样品的均匀性好。

 

2.7 供试品浓度

 

我们也考察了供试品浓度在小范围（±20%）内变化时对结果的影响。取一批供试品（A1）,按“2.3.2”项下方法配制浓度为1.6、1.8、2、2.2、2.4 mg·mL-1的供试品溶液,分别进样测试,Mw与RSD%结果与方法重复性基本一致。由于本实验以主峰保留时间作为分子量计算的依据,因此在适宜范围内,供试品浓度变化对实验结果无明显影响。

 

2.8 线性与范围

 

取PEG对照品430、1 030、2 100、3 450、5 800按 “2.4”项下方法测试,记录色谱图（见图1）,建立三阶校正曲线,得回归方程: LogM=0.00665T 3-0.372T 2+6.59T–33.710,R 2=0.9999。

 

2.9 溶液稳定性

 

取对照品（PEG 3450）溶液和供试品（A1）溶液,室温放置,分别于0 、4 、8、12、24 h进样分析,记录色谱图。结果对照品和供试品峰形无改变,峰高无减小,保留时间的RSD均小于0.52%,表明样品在溶液中结构稳定,同时流动相性质稳定。

 

2.10 校正曲线检查

 

由于本方法不是以色谱峰面积进行定量分析,不能以常规方法用对照品进行回收率试验,故我们设计了校正曲线检查,以验证方法的准确性。称取分子量2100、3450和5800的PEG对照品各3份,按“2.4”项下方法分别测定,用校正曲线计算各对照品的Mw,并与对照品证书标示值（Mw）比较,计算相对偏差%（见表1）。三个浓度水平的平均偏差分别为101.20%,99.05%,100.34%,均在分子量分布检测误差接受范围内,表明方法准确度好。

 

图1  聚乙二醇对照品校正曲线色谱图（对照品Mw430、1030、2100、3450、5800）

Fig.1   The chromatograms of PEG standards forcalibration curve（StandardsMw430, 1030, 2100, 3450, 5800）

 

图2  3个企业产品差示扫描量热法熔融曲线（A1,B1,C1）

Fig.2   Melting curves of PEG 3350 from 3 enterprisesby differential scanning calorimetry（A1,B1,C1）

 

图3  3个企业产品分子量分布检测色谱图（A1,B1,C1）

Fig.3  The chromatograms of molecular weight distribution of PEG 3350 from 3 enterprises（A1,B1,C1）

 

2.11  样品测定

 

取3个企业共9批样品（A1~A3；B1~B 3；C1~C3）照“2.3”项下方法,制备样品溶液,进样分析,结果（表2）表明,各批次产品的分布系数均较小（＜1.1）,说明产品分布宽度小；各企业的3批产品间分子量较接近（RSD%均＜2%）,说明各自生产工艺稳定,但企业间结果差异明显,A厂产品分子量大于B厂约10%,大于C厂约5%,虽然根据PEG 3350 的产品标准三家企业均符合规定,但其内在质量预期有一定的差异,将在后续讨论中说明；另外,我们也依据药典方法[6]对9批样品的平均分子量进行了测定,结果（表2）与GPC法的结果基本一致。

 

表1  校正曲线的检查

Tab.1  Accuracy of the calibration curve

 

注（Notes）: 1: 三阶曲线（Third order curve）: LogM=0.00665T3-0.372T2+6.59T–33.710,R2=0.999 9; 2: 一阶曲线（First order curve）: LogM=-0.313T+8.890,R2=0.998 1; 3: 二阶曲线（Secondorder curve）: LogM=-0.001 07T2+0.073 4T+5.403, R2=0.9995; 4: 四阶曲线（Forthorder curve）: LogM=0.004 29T4–0.303 5T3+8.02T2-94.1T +418.619,R2=1.000 0

 

表2  3个企业9批聚乙二醇3350的分子量测定结果

Tab.2  Determination results formolecular weight distribution of 9 batches PEG 3350 from 3 enterprises

 

3  讨论

 

3.1  色谱条件的选择

 

进行了高分子化合物分析,色谱柱是影响分离效果的最重要因素。我们对比了OHpak、TSKgel等几款产品,Agilent PL aquagel-OH 20为粗内径、大颗粒填料的体积排阻色谱柱,适合分析的化合物分子量范围为100~20 000,经过试验,该柱获得的色谱峰对称、峰宽小、保留时间适宜,故选择此柱为基础进行后续试验（见图1）。流动相中0.1 mol·L-1硝酸钠用于维持溶液的离子浓度稳定,有利于获得良好色谱峰形,ProClinTM是新型有机抑菌剂,低毒,环境友好,较低浓度可获得抑菌效果,避免了以往凝胶色谱流动相中使用叠氮化钠这类毒性强的抑菌剂对实验人员和环境的危害。在该色谱柱推荐的流速范围（0.5~1.0 mL·min-1）和柱温范围（20~65 ℃）内,我们考察了方法的耐用性。结果,不同条件对色谱峰保留时间及峰宽有影响,除极端情况（1.0 mL·min-1、65 ℃）导致不同分子量对照品出峰过快、拟合曲线分辨能力下降、样品测定精密度差以外,常规流速（0.5~0.8 mL·min-1）和柱温（20~40 ℃）对样品测定结果并无明显影响。

 

3.2 校正曲线的选择

 

建立GPC分子量测定方法时,数据处理参数的确定需要不断尝试,在能够获得同品种对照品的情况下,以Waters empower软件为例,首先确定“相关”模式进行数据处理,再优化回归曲线类型。本文比较了从一阶到五阶曲线对测定结果准确度的影响（见表1）,在选择的2100、3450、5800三个分子量对照品校正点处,三阶曲线拟合准确度最好（均小于2.0%）,一阶和二阶曲线准确度较低,五阶曲线由于总校正点数的限制不能拟合,四阶曲线的准确度虽然较小,但该拟合类型不适合分子量范围小、校正点数少的情况。故最终选择三阶曲线用于样品计算。

 

3.3 DSC方法参数的选择

 

DSC是在程序控温下,测定化合物热流量随温度变化的技术,通过热效应曲线的分析,可以研究物质的熔点、相转变、聚合物组成等信息[9]。为了准确测定PEG的热效应曲线,前期实验对起始温度、升温速率、终止温度、载样量等参数进行优化比较。结果（1）低于PEG 3350熔点（约为60 ℃）10 ℃以上,主峰峰形和峰值熔点没有明显影响,为反映低熔点组分的信息并尽可能缩短时间,确定起始温度为40 ℃；（2）不同的升温速率（1~10 ℃·min-1）直接决定了热效应曲线的分辨能力,5 ℃·min-1以上时,由于升温较快,PEG峰的变化细节被压缩,低熔点峰不能观察到,反之1 ℃·min-1时,所有峰加宽,分离有所提高,但时间过长,且得不到更多有效信息,故选定2 ℃·min-1；（3）PEG主峰之后,温度约61℃,PEG3350 完全熔化,曲线平直,延续到100 ℃没有其他热效应,故设定80 ℃为终止温度能够显示完整主峰；（4）样品量设定在2~3 mg比较适宜,由于铝坩埚装载体积的限制,加入更多样品导致热传导的延迟,使PEG吸热峰变宽严重,曲线毛刺多,呈现过载的特征,不利于获取有效信息。对B1样品反复测试,显示峰形、峰位重现良好,峰值熔点偏差在0.2℃以内,表明DSC方法重复性及B1样品的均匀性较好。

 

3.4 产品质量分析

 

如前所述,3个企业各批次产品分子量均符合规定（±10%）,分布系数也十分接近,A企业分子量均值更接近标示值3350,质量上应该更好,但结合色谱图（图2）,发现B、C厂色谱峰更对称平滑,A厂色谱峰有小的前沿峰,根据体积排阻色谱原理,分子量大的成分更早流出色谱柱,提示样品中含有一定比例且分子量集中的高分子组分。不同分子量的PEG具有不同的热力学参数,可以通过DSC曲线直观反映[10]。故我们进一步通过DSC考察了产品的熔融过程升温曲线（方法见“2.2”项下）,图2显示A1和C1批样品均测得低共熔峰（55.14℃、55.25℃）,且A1中比例更大,与主峰熔点（A1 59.67℃、C1 59.77℃）有差异明显,表明存在低共熔组分,其热性质与主成分有一定差异。而B1的熔融曲线呈单峰且熔程更窄,提示分子量组成更集中,离散的程度更小。B1峰值熔点为59.06℃比A1、C1更低,这与B1分子量三者中最小相吻合。为研究低共熔该现象,我们用分子量为2 000和6 000的PEG分别与PEG 3350按不同比例混合模拟A1、C1两批样品,但受制于实验室小规模制样技术,始终不能模拟出按既定工艺的大生产样品,不能得到类似的热分析曲线,没能确定低共熔组分的分子量情况以及在样品中的比例。这也说明热分析是一种高灵敏的分析方法,可以反映样品结构、组成方面细微的差异,对于多批样品质量一致性的监控有重要意义。

 

3.5 总结

 

高效凝胶渗透色谱是测定具有多分散性质的化合物分子量及其分布的有效方法,本文采用Agilent PL aquagel-OH 20（7.5 mm×300 mm,8 μm）色谱柱,建立了PEG 3350分子量分布测定方法,经过对色谱条件和积分处理方法优化和验证,表明该方法适合分子量400~5800范围内PEG的检测,能够获得重均分子量、分布系数等多分散化合物重要信息,结合DSC方法,能够发现不同企业样品间的更多质量差异,为生产企业多批产品质量均一性监控和制剂企业辅料对比筛选提供依据。

 

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程继业, 金伟斌, 顾晓风, 周震宇（苏州市药品检验检测研究中心, 江苏苏州 215104）