定量分析是在定性分析的基础上，需要纯物质作为标准样品。液相色谱的定量是相对的定量方法，即：由已知的标准样品推算出被测样品的量。

液相色谱法定量的依据

被测组分的量(W)与响应值(A)（峰高或峰面积）成正比,W=f×A。

定量校正因子(f)：是定量计算公式的比例常数，其物理意义时单位响应值（峰面积）所代表的被测组分的量。

由已知标准样品的量和其响应值可以求得定量校正因子。

测定未知组分的响应值，通过定量校正因子即可求得该组分的量。

定量分析常用术语：

样品（sample）：含有带测物，供色谱分析的溶液。分为标样和未知样。

标样（standard）：浓度已知的纯品。

未知样（unknow）：浓度待测的混合物。

样品量（sample weight）：待测样品的原始称样量。

稀释度（dilution）：未知样的稀释倍数。

组分（componance）：欲做定量分析的色谱峰，即含量未知的被测物。

组分的量（amount）：被测物质的含量（或浓度）。

积分（integerity）：由计算机对色谱峰进行的峰面积测量的计算过程。

校正曲线（calibration curve）：组分含量对响应值的线性曲线，由已知量的标准物建立，用于测定待测物的未知含量。

常用的定量方法

1外标法

标准曲线法，分为外标法和内标法。外标法在液相色谱中用的最多。内标法准确但是麻烦，在标准方法中用的最多。

用被测化合物的纯品作为标准样品，配制成一系列的已知浓度的标样。注入色谱柱的到其响应值（峰面积）。 

在一定范围内，标样的浓度与响应值之间存在较好的线性关系，即W=f×A，制成标准曲线。

在完全相同的实验条件下，注入未知样品，得到欲测组分的响应值。根据已知的系数f，即可求出欲测组分的浓度。

外标法的优点：

操作、计算简单，是一种常用的定量方法；无需各组分都被检出、洗脱；需要标样；标样及未知样品的测定条件要一致；进样体积要准确。

外标法缺点：

实验条件要求高，如检测器的灵敏度，流速、流动相组成的不能发生变化；每次进样体积要有好的重复性。

2内标法

操作：

将已知量的内标样加入标准样品，制成混合标样，并配制一系列的已知浓度的工作标样。混合标样中标样与内标样的摩尔比不变。注入色谱柱，以（标样峰面积/内标样峰面积）为响应值。根据响应值与工作标样浓度之间存在的线性关系，即W=f×A，制成标准曲线。

将已知量的内标样加入未知样品，注入色谱柱，得到欲测组分的响应值。根据已知的系数f，即可求出欲测组分的浓度。

内标法的特点：

操作过程中样品和内标是混合在一起注入色谱柱的，因此只要混合溶液中被测组分与内标的量的比值恒定，上样体积的变化不会影响影响定量结果。内标法抵消了上样体积，乃至流动相、检测器的影响，因此比外标法精确。

案例分析

案例分析一

我做的是苯酚羟基化反应，产物中有苯酚，苯二酚（邻，对），苯醌，焦油，用安捷伦1100液相色谱分析，外标法计算选择性和转化率。但一直以来，计算出的结果老是差强人意。偶尔算出一个好的结果，但是一重复又不行了，有时候重复做几次都不一样，很是郁闷。

最近又老算出来选择性超过100%。开始怀疑稀释误差的问题（样品是稀释以后去测的)，但现在操作的时候非常小心了，怀疑标准曲线的问题，但是重新做了好几条了。结果就是很奇怪，自己想了想：

1.因为液相色谱仪是公用的，所以特意买了专用的色谱柱。但经常测的时候发现柱压不一样，是不是因为这个影响了峰面积，进而影响了结果？柱压的影响这么大么？

2.是不是外标法就不准确？该用单点校正法？之前觉得每次测样前都配一个标样有点麻烦，所以没用。

3.还是别的什么原因？

补充：用的柱子是ZORBAX SB-C18, 用的甲醇：水=3：7，每个峰都分的很开。取样后离心去掉催化剂，再定量稀释然后去测的。

网友建言献策：

- 有时候确实柱压不同会对结果有影响，但这是柱压差别很大的情况才会发生。是不是柱子没冲洗好，或者需要看是否进气泡了，因为这都可能导致结果不准。

- 如果柱压的差别很大的话，比如30bar已经很大了，平时用的时候，有柱温箱，一般都控制温度恒定的，基本同意条件不会有这么大的变化，最多10bar上下浮动，通常小于5bar。

- 是不是走过缓冲盐的流动相？用水低流速长时间冲洗，再换乙腈冲洗试试看。是不是有些不物残留在柱子中没有及时冲洗导致柱压偏高，可以尝试用异丙醇试试。

- 柱压变化主要会影响保留时间，对峰面积影响不大。你所说的重复性不好，是液相进同一个样品重复不好还是不同的样品。如果不同的样品那是你反应的问题。至于选择性超过100%？是否是计算方法错误？

- 简单来说，计算苯二酚的选择性：

假设对苯峰面积代入标准曲线得浓度C1(g/ml)；邻苯峰面积对应浓度C2，苯酚峰面积对应浓度C，溶液总体积V，稀释倍数20，初始苯酚加入量m(g),如下

- 计算公式如果没错，可以看看是否自己没有做过空白以及反应投料时的组分测试。

- 至于单点还是外标法？

单点校正比较简单，如果要求不是很严格的话，单点校正可以满足要求。单点标准浓度如果在被测样品浓度附近，结果比外标法更准确。做考核样时，我们一般先用外标法定出大致浓度范围，再以单点法定量。

单点一般适用于线性曲线截距在100%浓度点2%以下的。高于20%不能采用单点校正和外标。外标法对照和拱式样品浓度应一致，校正曲线线性符合即可。

案例分析二

我想用液相色谱进行定量分析，使用外标法。问题是：标准曲线是不是每次测定样品时都要做一次？我有200个样品，但不是一次能做好，每次我可以测20个样品。难道我每次测定前都要先做一下标准曲线？我是同一台仪器，同一条件。

网友建言献策：

从严格意义上来讲应该是每天做一条标准曲线。如果你做的东西要求不是太严格（不需要报批），可以考虑隔几天做一天标曲。不可否认的是，每天都做标准曲线能减小测量的数据的误差。

但是如果是药品检测，是应该每次开机测定样品前做一条标准曲线或单点校正标准溶液分析，但普通化工分析要求不严就没有必要每次做曲线，因为差异不大的。但如果是检测单位检测样品，就要根据标准来执行了。说白了其实是规范不规范的问题。