遗传毒性杂质在很低的浓度下即可诱导基因突变以及染色体的断裂和重排，因而具有潜在的致癌性。在缺乏杂质安全性数据支持的情况下，在EMA，FDA以及ICH发布的指导原则中均将警示结构作为区分普通杂质和潜在遗传毒性杂质的主要标志。本文就警示结构的起源、发展和识别进行简要论述。

药品并非纯净物质，在其生产和贮运过程中会引入和产生杂质。由于杂质的存在会带来潜在的安全性风险，对患者“有害无益”，需要在充分研究基础上加以有效控制。其中，具有潜在致癌性的杂质，更是杂质研究和控制的重点。

自1996年起，ICH相继发布原料药杂质研究指导原则（ICHQ3A）、制剂杂质研究指导原则（ICH Q3B）和残留溶剂研究指导原则（ICHQ3C），针对有机杂质、残留溶剂的研究和控制建立了全球多数国家和地区遵循的统一标准。这些指导原则中也及“对于能够产生强的药理活性或毒性的潜在杂质，即使其含量低于0.1%，仍然建议进行结构鉴定研究”。在之后的修订版中，还进一步明确“要关注原料药中的潜在遗传毒性杂质”，以及“对于毒性非常强的杂质，可能需要制定更低的限度”，但是其中并未明确阐述遗传毒性杂质的研究和控制问题，也未提出具体的研究原则、控制策略和限度要求。

由于遗传毒性杂质（前期也译为“基因毒性杂质”）在很低的浓度下即可诱导基因突变并导致染色体的断裂和重排，因此具有潜在的致癌性，近年来广受关注。欧盟、美国药品监管机构相继发布了遗传毒性和致癌性杂质的指导原则。在此基础上，ICH也针对遗传毒性杂质着手制订M7指导原则，目前已经发布了草案。这些指导原则为遗传毒性杂质的确认、研究和控制提供了指导性建议和技术要求。但是，由于杂质化学结构的多样性，对于绝大多数的杂质而言，往往没有充分的基因毒性或致癌性研究数据，因而难以对其归类。在缺乏安全性数据支持的情况下，这些指导原则采用“警示结构”作为区分普通杂质和遗传毒性杂质的标志；对于含有警示结构的杂质，应当进行（定量）构-型关系[（Q）SAR]预测和体内外遗传毒性和致癌性研究，或者将杂质水平控制在毒理学关注阀（TTC）之下。

1.警示结构的起源和发展

化学物质的生物活性（包括毒性）是其自身与生物体内的特定分子相互作用的结果。警示结构正是起源于化合物结构与生物活性的关系研究，尤其是化学结构与毒理学活性之间的关系[]。化学物质中存在的某些功能基团或亚结构单元使其具备与生物体内功能性大分子发生反应的能力，从而表现出这样那样的生物活性。因此化学物质的特定基团或亚结构对其生理活性具有提示作用；就化合物的毒性而言，更确切的说是具有“警示”作用。

致癌性是目前最受关注的一类毒性反应。20世纪80年代，Weisburger等开始根据致癌性的产生机制对化学致癌物进行分类研究。目前，一般将致癌物分成两大类：一类是遗传毒性致癌物（geno-toxic carcinogens），通过化学键合直接破坏遗传物质产生致癌性，大多数的化学致癌物具有遗传毒性；第二类是非遗传毒性致癌物（epicarcinogens，或称为外遗传性致癌物），通常不与DNA发生化学键合作用，不对DNA产生直接破坏，而是通过遗传物质外的间接机制引起致癌作用（如促进细胞过度增殖等），这类致癌物在致突变试验（如Ames试验）中一般呈阴性结果。尽管非遗传毒性致癌物的致癌作用机制各不相同，但遗传毒性致癌物的作用机制却表现出较高的一致性，这类物质具有DNA反应活性，通过与遗传物质发生化学键合引起遗传信息的改变并产生致癌性。研究证实，基因突变往往是此类物质产生致癌性的起始步骤。

1970年代，James和Elizabeth Miller夫妇在研究“烷化剂”和“酰化剂”的致癌性的基础上，首先提出了化学致癌物具有亲电性的假设10l；后期的研究又发现，一些本身不具有亲电性的物质（如苯胺），通过生物转化后变成了具有亲电活性的代谢产物，因此也具有致癌性。这些发现直接导致了“亲电性致癌论”的提出”。这一理论认为“几乎所有的化学致癌过程都是亲电活性的物质（要么自身具有亲电性，要么通过体内代谢过程转化为具有亲电性的物质）与生物体内的亲核性物质（如核酸、蛋白等）发生结合反应的结果”。时至今日，对于遗传毒性致癌物而言，这一理论仍然得到广泛认可，并已成为多个商业化和非商业的毒性预测软件的理论基础。

所谓遗传毒性杂质的警示结构，是指杂质结构中的某些特殊基团或亚单位。这些特殊的结构单元具有与遗传物质发生化学反应的能力，一旦与遗传物质发生反应，则会诱导基因突变或者导致染色体重排/断裂，因此具有潜在的致癌风险。

在Miller夫妇提出致癌物的亲电性理论以后，有大量研究人员参与到化学结构和致癌性关系的研究中，有关致癌性化学物质警示结构的报道日益增加。其中Ashby等]总结提出了18种警示结构的模型，并将这些结构特征整合到一个“超级致癌物”的虚拟分子结构中。

相对于普通杂质，致癌性杂质特别是遗传毒性杂质的安全阀值较低，在很低的浓度下即可能产生致癌风险，因此对其控制要求更加严格，由此给生产工艺和检测手段提出了更高的要求，相应地提高了药品研发和生产控制的成本。警示结构对于杂质的遗传毒性和致癌性具有提示作用，对于警示结构的早期识别和规避有助于提高药物研发的效率、降低生产和控制成本。

2.典型的警示结构示例

Benigni等在前人研究的基础上，对遗传毒性和致癌性的警示结构进行了总结和归纳。其中表1为典型的遗传毒性致癌性物的警示结构，表2为几个常见的非遗传毒性致癌物的警示结构。

表1和表2中汇总的警示结构是在多个文献的基础上汇总而来，并且已经在一些遗传毒性和致癌性的预测软件（如Toxtree）中有多年应用。

应当注意，含有警示结构并不意味着该杂质一定具有遗传毒性，而确认有遗传毒性的物质也不一定会产生致癌作用。杂质的理化性质和其他结构特点（如相对分子质量、亲水性、分子对称性/空间位阻、反应活性以及生物代谢速率等）会对其毒性产生抑制或调节作用。警示结构的重要性在于它提示了可能存在的遗传毒性和致癌性，为进一步的杂质安全性评价和控制策略的选择指明方向。例如，在ICHM7指导原则草案中，基于基因毒性和致癌性将杂质分为5类，其中第3类就是没有遗传毒性数据，但含有与原料药本身结构无关的警示结构的杂质。对第3类杂质，可以选择按照指导原则要求将其含量控制在可接受限度（TTC）以内，也可以选择开展细菌致突变试验确定其是否具有遗传毒性，进而确定合理的控制策略。

3.结语

在药物开发过程中，遗传毒性和致癌性杂质的研究和控制涉及多个学科，例如原料药合成工艺、分析、毒理等。在这个多学科交叉的领域内，警示结构承担了连接工艺质控、分析检测、毒理学评估的纽带作用。

由于杂质结构的多样性特点，多数杂质的遗传毒性是没有实验数据支持的。基于大量理论研究和实践经验总结出的警示结构，对于杂质的潜在致癌性有一定提示作用。因此在进行杂质安全性评估和控制策略选择时，对于缺少遗传毒性数据的杂质，警示结构作为区分普通杂质和“高活性”杂质的标志可以提高筛选效率、减少毒理学评价的工作量。但是应当指出，警示结构的存在与否并不能明确给出该杂质是否具有遗传毒性和致癌性的结论。对于缺少遗传毒性数据的杂质，警示结构可以作为辨识遗传毒性和致癌性杂质的起点，之后才会考虑启动构-效关系预测和体内外安全性研究，以进一步确认该杂质是否具有遗传毒性和致癌性。