当前蛋白及多肽类药物研究的如火如荼，而蛋白质聚集是所有研发企业所面临的一个关键性难题。如若在整个生产工艺过程中蛋白质发生聚集，那么首先影响的是蛋白质的收率，更重要的是蛋白质聚集还会对蛋白质质量产生较大的影响，进而影响蛋白质的药效。因此了解蛋白质聚集的途径、影响因素和控制蛋白质聚集是十分必要的。
而蛋白质的聚集因素多种多样，如上游工艺以及下游工艺的影响，以及储存以及运输条件的影响等等。可以说稍不注意，蛋白质就会发生聚集。今天笔者就借用本篇文章来谈谈蛋白质聚集途径以及防控手段。
2、上游工艺的影响
（1）pH
pH是上游工艺中调节细胞生长和代谢物产生的关键参数之一。pH值会影响蛋白的稳定性。通常pH在等电点附近发生显著变化的话，特别是pH向等电点变化，会导致蛋白质部分去折叠，从而发生聚集。
（2）离子
在上游工艺中，我们会使用到一些培养基，涉及到如Cl-、SO42-、PO43-、NO3-、Na+、K+、Ca2+等。而这些阴离子和阳离子都会影响蛋白质的聚集。离子结合后蛋白质的构象发生变化，从而影响蛋白质的聚集。离子与蛋白质的结合本质上可以是放热的或吸热的。离子与放热位点的发结合可以稳定构象，进而抑制蛋白聚集。而离子与蛋白质的吸热结合破坏了稳定的结构，进而加速了蛋白的聚集。因此，了解离子与蛋白质的结合行为并通过调节离子类型或浓度，可以控制蛋白质的聚集行为。
（3）剪切/搅拌
蛋白质的机械搅拌或剪切可诱导或加速蛋白质的聚集，因为剪切/搅拌应力提供了诱导构象变化所需的活化能。此外，剪切/搅拌会增加蛋白质表面的疏水性，从而导致蛋白质的聚集。
（4）空气/水界面
蛋白质分子在开发、生产、运输和储存过程中由于机械搅拌和摇晃而暴露于空气/水界面。空气和蛋白质疏水区域之间的界面吸附导致蛋白质的构象变化从而聚集。空气/水界面对蛋白聚集的影响取决于蛋白质的分子量以及疏水性。
（5）温度
分子内氢键对球状蛋白质的结构和稳定性至关重要。热能会破坏蛋白质的氢键，从而导致其展开，最后发生聚集。
图2 温度及机械能导致蛋白展开示意图
（6）蛋白质-赋形剂相互作用
蛋白质-赋形剂的相互作用取决于赋形剂和蛋白质的性质。在上游加工中，糖类、氨基酸和表面活性剂与蛋白质相互作用，从而蛋白质聚集。氨基酸的疏水性和电荷各不相同，会具有不同的聚集倾向。例如，精氨酸可抑制或加速聚集过程，这取决于分子间相互作用的类型。精氨酸与带负电荷的蛋白质的静电相互作用导致蛋白质加速聚集，而精氨酸与芳香族残基的相互作用抑制了蛋白质聚集。
3、下游工艺的影响
下游工艺涉及不同类型的一些相互作用，影响蛋白的稳定性。如在离子交换以及亲和层析的实验中会使用不同pH和离子强度的洗脱缓冲液，同时会存在过滤步骤，上述过程都会改变蛋白质的构象并增加聚集倾向。
（1）蛋白质-表面相互作用
蛋白质-表面相互作用会引起蛋白质二级结构的变化，特别是由于键的形成和断裂而导致螺旋性的丧失。例如，不锈钢是反应容器常用材料，而不锈钢微粒会引起蛋白产生一定的聚集。不锈钢表面不可逆吸附的蛋白质数量促进了聚集过程，吸附蛋白质的量在固液界面处表面诱导的蛋白质聚集中起关键作用。同时表面的粗糙程度对蛋白质聚集也有很大的影响。
（2）冻融、冻干及干燥
冻融和冻干通常是下游加工过程中的最后一步，并会诱导蛋白质的聚集。以上过程可能会导致pH值变化，从而导致聚集。此外，蛋白质的干燥也会导致构象变化。
4、其他过程的物理化学因素
其他各种因素，如化学修饰以及储存也会影响蛋白质的稳定性。例如，脱酰胺化化学修饰会增加蛋白的聚集，由于修饰后蛋白的的疏水性增加，mAb1和mAb2的脱酰胺化增强了其在较低的pH值时的聚集。
总之，蛋白质的天然构象是通过不同的分子内作用力来稳定的，如氢键、二硫键、静电、疏水相互作用等，氢键对于蛋白质的稳定性是很关键的。因此，如果生产及储存过程中产生的热、化学和耗散能打破了分子内作用力，就会导致蛋白展开，从而聚集。下表1列出了影响蛋白稳定性的不同因素以及相互作用类型。
5、如何控制蛋白质聚集？
（1）蛋白质结构修饰
蛋白质的结构影响着蛋白质的聚集，所以我们放置蛋白质聚集的第一种手段就是对蛋白质的结构进行修饰以及改造。例如我们可以改变蛋白质结合区域的凹面静电势，修饰后蛋白间的静电力减少，这样就可以有效的防止蛋白质的聚集。
此外我们对于蛋白质的糖基化修饰不完整的糖链应特别关注，因为这种情况下很容易导致蛋白质的聚集，在浓缩的过程中更容易产生聚合物。
（2）生产工艺过程控制
首先在培养基中可以添加CuSO4，这样可以使游离醇含量降低，从而促进二硫键的生成，这样就减少了以共价键形成的蛋白质聚合物。
另外在超滤浓缩前的搅拌等步骤是容易发生聚集的，可以通过使用具有不同结构的超滤膜以及通过添加表面活性剂减少蛋白质聚集的形成。
在色谱层析过程中，蛋白质的饱和结合导致层析柱表面蛋白质浓度升高，进而产生聚集。一般可以使用精氨酸作为洗脱保护剂而减弱蛋白质的聚集。此外流动相中不同的盐也会对蛋白质聚集产生不同的影响，所以对于流动相的组成的选择需要认真研究。
（3）运输及贮存过程控制
当前有多种具有抑制蛋白质聚集的分子和材料被发现以及应用。以半胱氨酸反应小分子ebselen为例，其能够有效促进二硫键的形成，进而减少蛋白质聚合物的产生。此过程最为关键的还是选择合适的包装材料。
6、小结
蛋白在制备以及存放过程会有多种因素影响其稳定性，要保证蛋白的疗效，那么首先就要确保蛋白的构象没有改变。而如何降低实验以及存放过程蛋白构象的改变？那就要了解蛋白在各种因素下，如热、化学和机械应力、吸附和离子强度下的变化，进而分析蛋白在这些条件下的聚集倾向和聚集机制，以确保其疗效和患者的安全性。以下为蛋白生产及存储过程中小编的几点建议：
（1）在优化细胞培养的pH、温度和离子强度时，还应考虑对蛋白质稳定性的影响；
（2）当蛋白反应器械及存储包材接触时，应确认表面化学和粗糙度对吸附量和构象变化的影响；
（3）基本了解温度、pH、盐浓度、离子强度、剪切对蛋白质稳定性的影响是必要的；认识到这些因素的积极影响和不利影响，将有助于提高稳定性；
（4）目前具有多种表面改性策略，可应适表面改性，提高稳定性；
（5）识别易聚集区域，这样则可以减少蛋白质聚集倾向，可以使用聚集预测工具来确定易聚集区域。
总之，应系统地探索上游、下游和储存过程的物理化学因素对治疗性蛋白质稳定性的影响，以减轻药物损失，从而确保疗效。
参考文献
[1]Physicochemical factors of bioprocessing impact the stability of therapeutic proteins.
[2] Poulson B G , Szczepski K , Lachowicz J I , et al. Aggregation of biologically important peptides and proteins: inhibition or acceleration depending on protein and metal ion concentrations[J]. The Royal Society of Chemistry, 2020(1).
[3]付娜, 王捷. 蛋白质聚集的形成与调控机制[J]. 生命的化学, 2007, 27(5):4.
