摘 要： 建立柱前衍生-高效液相色谱（HPLC）联合紫外检测分析方法测定冰乙酸中微量乙酸酐的含量。样品采用吗啡啉为柱前衍生剂，色谱柱为Atlantis T3（250 mm×4.6 mm， 5 μm），以磷酸水溶液（pH 3.0）-甲醇（体积比为95∶5） 为流动相，流量为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为210 nm。乙酸酐的质量浓度在2.60~25.97 μg/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数为0.999 9，检出限为0.8 μg/mL，定量限为3 μg/mL。平均样品加标回收率为92.8%~99.2%，测定结果的相对标准偏差为0.9%~2.3%（n=6）。该方法可用于冰乙酸中微量乙酸酐的含量测定。

关键词： 吗啡啉； 乙酸酐； 冰乙酸； 柱前衍生； 高效液相色谱法

 

冰乙酸是一种有机一元酸，具有强烈刺激性气味，在试剂分析、非水滴定等方面运用广泛，同时冰乙酸是一种重要的有机合成原料，多应用于醋酸纤维、农药、医药、染料等生产行业[1‒3]。目前，乙酸的工业制备方法主要为甲醇低压羰基合成法、丁烷氧化法和乙醛氧化法[4]。由于生产工艺的差异，乙酸中的杂质也多种多样，GB/T 676—2007 《化学试剂 乙酸(冰醋酸)》显示冰乙酸中常含有乙酸酐、重金属、硫酸盐等杂质。

乙酸酐，又名乙酐或醋酐，其分子结构是由两分子乙酸失去一分子水而形成的酸酐，可用作溶剂、脱水剂和聚合物引发剂。此外，乙酸酐还是一种比较活泼的乙酰化试剂，能与醇、酚和胺等形成乙酸酯和乙酰胺类化合物[5‒7]，常用于生产纤维素乙酸酯、医药、农药和香料等。由于冰乙酸中乙酸酐含量过多，可能导致后续合成产品中存在较多小分子副产物，在医药领域中，会增大未知杂质的产生风险，降低原料药或制剂的质量，因此对冰乙酸中乙酸酐含量的测定在药品研发中具有重要的研究意义。

国内外检测乙酸及其衍生物的研究文献较多[8‒12]，但大多不适用于检测乙酸酐，目前检测酸酐类化合物的方法主要有比色法[13]、化学滴定法[14]和气相色谱法[15‒18]。其中，比色法是通过在酸性条件下反应生成红色的异羟肟酸铁的方法来测定酸酐含量，操作步骤繁琐，高氯酸具有刺激性、强腐蚀性等特点，且人工目视比色的准确度相对于仪器分析的误差比较大；化学滴定法的原理是利用酸酐水解生成酸，与碱性标准溶液反应来测定其含量，该方法检出限较高，指示剂变色的敏锐程度和用量直接影响定量结果，重现性较差，而且样品中若含有其他酸性化合物，易对测定结果造成干扰；在使用气相色谱法时，如果样品自身结构比较复杂，需要开发特殊的前处理方式，耗时且费用成本较高。此外，高温易导致有机酸脱水生成酸酐，造成酸酐测试误差[19]。近年来，报道用液相色谱方法检测乙酸酐的文章极少，杨成钰等[20]利用二甲胺衍生高效液相色谱（HPLC）法测定吗啉噁酮中残留的少量乙酸酐，但是该方法的衍生条件操作复杂，试剂种类较多，二氯甲烷毒害性强且易挥发。建立一种用于检测冰乙酸中乙酸酐的既简单易操作又可靠环保的样品前处理方法是十分必要的。

笔者根据吗啡啉与乙酸酐易反应生成乙酰吗啉[19]的原理，首次提出了以吗啡啉作为衍生化试剂的柱前衍生化HPLC法，该方法衍生效率高、重复性好、快速且定量准确，适用于测定冰乙酸中微量乙酸酐的含量，从而达到控制冰乙酸的产品质量，为药品研发工作提供指导性建议。

 

1、 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：1260型，带有紫外-可见检测器，美国安捷伦科技有限公司。

多参数测试仪：S975型，测量精度为0.01，瑞士梅特勒-托利多有限公司。

分析天平：MSA225S-1CE-DA型，感应量为0.01 mg，德国赛多利斯集团。

乙酸酐：纯度（质量分数）为98.5%，批号为20210820，上海凌峰化学试剂有限公司。

吗啡啉：纯度（质量分数）为99.0%，批号为F181208，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

乙腈、甲醇：均为色谱纯，天津市康科德科技有限公司。

磷酸、氢氧化钠：均为分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司。

冰乙酸：色谱纯，批号为K54173956210，德国默克公司。

实验用水：超纯水，由密理博纯水仪制得。

1.2 色谱条件

色谱柱：Waters Atlantis T3柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm，美国沃特世公司）；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：210 nm；进样体积：40 μL；柱温：30 ℃；流动相：甲醇-pH为3.0磷酸水溶液（体积比为5∶95）；流量：1.0 mL/min；洗脱方式：等度洗脱。

1.3 实验步骤

1.3.1 溶液配制

磷酸水溶液：于1 000 mL水中加入磷酸0.7 mL，用饱和氢氧化钠溶液调节pH值至3.0。

吗啡啉衍生剂：取吗啡啉适量，精密称定，加乙腈溶解并定量稀释成质量浓度为50 mg/mL的溶液。

空白溶液：精密量取1.0 mL乙腈，置于20 mL量瓶中，加吗啡啉衍生剂0.5 mL，室温下衍生1 min，加磷酸水溶液稀释至标线，摇匀。

对照品储备液：取乙酸酐适量，精密称定，加乙腈溶解并定量稀释成质量浓度为625 μg/mL的溶液，作为对照品储备液1；精密量取1.0 mL对照品储备液1，置50 mL量瓶中，用乙腈稀释至标线，摇匀，作为对照品储备液2。

对照品溶液：精密量取1.0 mL对照品储备液2，置20 mL量瓶中，加吗啡啉衍生剂0.5 mL，室温下衍生1 min，加磷酸水溶液稀释至标线，摇匀。

样品溶液：取0.5 g冰乙酸，精密称定，置于20 mL量瓶中，加入吗啡啉衍生剂0.5 mL，混匀后室温下衍生1 min，加磷酸水溶液稀释至标线，摇匀，用0.22 μm 针头式滤膜过滤，取滤液作为样品溶液。

1.3.2 定量方法

取上述溶液，按照1.2色谱条件进样分析，记录色谱峰峰面积，然后按照外标法计算样品中的乙酸酐含量。

 

2、 结果与讨论

 

2.1 色谱柱的选择

分别选择Waters Atlantis T3柱 和XSelect HSS T3柱两种色谱柱进行试验，结果发现，衍生产物附近均无干扰峰，说明在相同的测试条件下，选择T3类色谱柱可满足测试要求，实验室可根据实际情况选择色谱柱。

2.2 色谱条件的筛选

分别考察0.9、1.0、1.1 mL/min 3种流量条件下的分离效果，结果表明，在不同流量下，除了乙酸酐衍生物的保留时间有变化外，信号响应、分离度、拖尾因子和理论板数等均无明显变化，故选择常用流速1.0 mL/min。

考察柱温分别为25、30、35 ℃时对测定结果的影响，结果显示，随着柱温的升高，乙酸酐衍生物的保留时间从17.6 min缩短至15.4 min，变化趋势不大。当柱温为35 ℃时，目标峰与相邻杂质的分离度略有减小；当柱温为25 ℃和30 ℃时，色谱峰峰形对称，分离良好，拖尾因子为1.0～1.1，理论板数均大于12 000。由于25 ℃柱温对实验室控温要求较高，因此选择30 ℃作为最优条件。

2.3 衍生条件选择

2.3.1 衍生反应时间

分别选择在0.5、1、30、60、120、180 min条件下进行衍生试验，加标样品中乙酸酐衍生物的峰面积依次为110 623、109 150、107 191、105 742、105 209、108 252，结果表明在0.5 min内衍生反应已完全，为方便计时，反应时间选择1 min。

2.3.2 衍生反应温度

考察衍生反应温度分别为10、25、60 ℃时对衍生反应的影响，结果显示加标样品中乙酸酐衍生物的峰面积无明显变化，说明温度对衍生反应影响不大，为方便操作，选择室温作为衍生乙酸酐的反应温度。

2.3.3 衍生剂用量

衍生试剂用量可能会对衍生结果产生影响，因此评估不同吗啡啉衍生剂用量（0.05、0.1、0.5、1、2、3.5 mL）对衍生反应的效果。测定结果表明，衍生剂用量不同时，加标样品中乙酸酐衍生物的峰面积无明显变化，说明当衍生剂用量为0.05 mL时，反应已完全，为避免较小取样体积引起的结果偏差，衍生剂的用量选用0.5 mL。

2.4 色谱图

在1.2色谱条件下，分别对空白溶液、对照品溶液、样品溶液及加标样品溶液进行测定，4种溶液的高效液相色谱图见图1～图4。由图1～图4可知，在空白溶液色谱图中，目标峰附近无干扰峰。在对照品溶液和加标样品溶液色谱图中，乙酸酐衍生物的保留时间为16.8 min，色谱峰峰形尖锐、对称，分离良好。

图1   空白溶液色谱图

Fig. 1   Chromatogram of blank solution

t/min

 

图2   对照品溶液色谱图

Fig. 2   Chromatogram of standard solution

t/min

 

图3   样品溶液色谱图

Fig. 3   Chromatogram of sample solution

t/min

 

图4   加标样品溶液色谱图

Fig. 4   Chromatogram of spiked sample solution

t/min

 

2.5 线性方程

分别精密量取0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL对照品储备溶液1，置于50 mL量瓶中，用乙腈稀释至标线，摇匀，作为线性储备液，再按照对照品溶液配制方法分别进行衍生化反应，得乙酸酐衍生物系列标准工作溶液，按1.2色谱条件测定。以线性储备液中乙酸酐的质量浓度(x，μg/mL)为横坐标，色谱峰面积(y)为纵坐标，绘制标准工作曲线。乙酸酐的质量浓度在2.60～25.97 μg/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，线性方程y=8 093.257 2x-1 860.365 9，相关系数(r)为0.999 9。

2.6 定量限及检出限

取对照品储备液2逐步稀释至一定浓度后进行衍生，按1.2色谱条件进行测定，记录峰高，当乙酸酐衍生物信噪比为10时，得到该方法的定量限浓度为3 μg/mL，当乙酸酐衍生物信噪比为3时，得到该方法的检出限浓度为0.8 μg/mL。

2.7 样品加标回收与精密度试验

在冰乙酸样品中分别加入2.60、6.49、12.98、19.48 μg/mL 4种质量浓度水平的乙酸酐溶液进行加标回收试验，进行衍生化反应后按1.2色谱条件进行测定，试验结果见表1。由表1可知，样品加标平均回收率为92.8%～99.2%，测定结果的相对标准偏差(RSD)为0.9%～2.3%(n=6)，表明该方法具有较高的准确度和较好的精密度，满足实际样品的测定要求。

表1   样品加标回收与精密度试验结果

Tab. 1   Sample spiking recovery and precision test results

 

2.8 溶液稳定性

取冰乙酸0.5 g，精密称定，置于20 mL量瓶中，精密加入12.98 μg/mL的乙酸酐溶液1.0 mL，加入吗啡啉衍生剂0.5 mL，混匀后室温下衍生1 min，加入磷酸水溶液稀释至标线，摇匀，分别于室温下放置0、20、48、72 h后按照1.2色谱条件进行测定，记录色谱峰面积，稳定性试验结果见表2。由表2可知，衍生产物的色谱峰面积无明显变化，测定结果的相对标准偏差为0.62%，表明该衍生产物在室温下放置72 h内具有良好的稳定性，在此期间可进行进一步的定量分析研究。

表2   稳定性试验结果

Tab. 2   Results of stability test

 

3、 结论

 

由于样品基质成分简单，干扰较少，测定单一组分乙酸酐衍生物所需时间略长。

理论上，衍生化反应温度、时间和衍生剂的用量对衍生化反应均有影响，但单因素试验结果显示反应温度、时间和衍生剂用量对衍生反应影响较小，故不再进行正交试验筛选最佳反应条件。

建立了以吗啡啉为衍生化试剂，柱前衍生化高效液相色谱测定冰乙酸中微量乙酸酐含量的检测方法，考察了该方法的精密度、加标回收率和定量限，结果表明该方法精密度高、回收率良好、反应条件温和、基质干扰小、成本低且灵敏度高，适用于冰乙酸中乙酸酐的质量控制。

 

 

 

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引用本文： 王锦，黄哲，曹婉，等 . 柱前衍生-高效液相色谱法测定冰乙酸中微量乙酸酐［J］. 化学分析计量，2024，33（8）：69. (WANG Jin, HUANG Zhe, CAO Wan, et al. Determination of acetic anhydride in glacial acetic acid by HPLC with pre-column derivatization[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(8): 69.)